蓋瓊輝，王春林

(隴東學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

深色果蔬維生素C檢測(cè)方法的優(yōu)化與比較

蓋瓊輝，王春林

(隴東學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

目的：優(yōu)化2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法檢測(cè)維生素C含量操作規(guī)范性及適用性。方法：對(duì)檢測(cè)條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時(shí)間、提取劑及濃度的選擇、提取過(guò)程、脫色劑用量及2種檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行比較。結(jié)果：高效液相色譜法檢測(cè)設(shè)置C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱，0.1%草酸為流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，所得圖譜保留時(shí)間適宜，峰形良好，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=46 116x+173.26，R2為0.999 2；維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃保存下48h內(nèi)可用、2，6-二氯靛酚鈉溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用，待測(cè)液制備完成后應(yīng)立即測(cè)定，若無(wú)法立即測(cè)定，可于4～6℃冰箱中保存1.5h；2%草酸為提取劑效果最佳，樣品加提取液勻漿后迅速定容、過(guò)濾和檢測(cè)，不可久置；使用2，6-二氯靛酚鈉滴定法時(shí)需添加0.4g/30mL的活性炭進(jìn)行脫色；精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率均符合測(cè)定要求。結(jié)論：2種檢測(cè)方法都適用于深色果蔬維生素C含量檢測(cè)，各有特點(diǎn)，可根據(jù)測(cè)定要求及實(shí)際條件選擇適宜的方法。

深色果蔬；草莓；維生素C；高效液相色譜；2，6-二氯靛酚鈉

維生素C是維持人體正常生命過(guò)程所必需的一類有機(jī)物[1]，主要有提高免疫力、保護(hù)牙齒和牙齦、預(yù)防癌癥、心臟病、中風(fēng)等作用。維生素C主要以還原型形態(tài)存在于新鮮蔬果中，也有以氧化型及少量結(jié)合態(tài)存在，其含量是評(píng)定果蔬營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。草莓為薔薇科多年生草本植物[2]，其果實(shí)顏色紅艷，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有豐富的維生素C及色素，可作為深色果蔬的典型代表。

維生素C的測(cè)定方法有很多種，包括滴定法、分光光度法、熒光法、電極法、薄層色譜法及高效液相色譜法等，這些方法各有其特點(diǎn)和不足[3-4]。目前常用的檢測(cè)方法主要為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法兩種，但各種文獻(xiàn)報(bào)道中[5-10]這兩種檢測(cè)方法所使用的提取劑、提取過(guò)程、脫色劑、試劑及待測(cè)液的保存溫度和時(shí)間等具體操作條件并不一致，對(duì)檢測(cè)結(jié)果可能造成影響。本文以深色果蔬草莓為材料對(duì)維生素C測(cè)定過(guò)程中涉及到的檢測(cè)條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時(shí)間、提取劑及濃度的選擇、提取過(guò)程、脫色劑用量及兩種檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了比較研究，為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法檢測(cè)維生素C含量的操作規(guī)范性及適用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和主要儀器

供試材料：2016年4月1日—5月1日期間市售草莓。

試劑：抗壞血酸(標(biāo)準(zhǔn)品)、2，6-二氯靛酚鈉鹽(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、草酸(分析純)、偏磷酸(分析純)、醋酸(分析純)、活性炭、甲醇(色譜純)、超純水等。

主要儀器：HZK-FA210型電子分析天平，成都欣宇實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JJ-2型組織搗碎機(jī)，上海書(shū)俊儀器設(shè)備有限公司；JPS-30A型超聲波清洗儀，鄭州渤銳超聲波設(shè)備有限公司；BILON-HL-205型恒溫水浴鍋，上海比朗儀器制造有限公司；JD-7200K型高速離心機(jī)，武漢晟睿明科學(xué)儀器有限公司；S-300型溶劑過(guò)濾裝置，天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Ajilent 1100型高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器)，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 2，6-二氯靛酚鈉(2，6-DCIP)溶液的制備、標(biāo)定及樣品測(cè)定[11]稱取52mg NaHCO3溶解于200mL沸水中，加入50mg 2，6-二氯靛酚，冷卻后過(guò)濾、定容于250mL棕色容量瓶中，冰箱中冷藏保存，每次滴定前用1mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行標(biāo)定。即取1mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，加入9mL 2%草酸，搖勻，用2，6-DCIP溶液滴定，以生成為紅色持續(xù)15s不退為終點(diǎn)，記錄2，6-DCIP溶液的消耗體積，計(jì)算每mL 2，6-DCIP溶液相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)，記為T值。樣品測(cè)定時(shí)取待測(cè)樣液10 mL，搖勻，用2，6-DCIP溶液滴定，以生成為紅色持續(xù)15s不退為終點(diǎn)，記錄2，6-DCIP溶液的消耗體積，另取10 mL 2%草酸作空白對(duì)照滴定，平行操作2次。樣品中維生素C含量測(cè)定如式(1)：

(1)

式(1)中：VA為樣品滴定消耗2，6-DCIP溶液體積平均值(mL)；VB為空白滴定消耗2，6-DCIP溶液體積平均值(mL)；C為樣品提取液定容體積(mL)；T為每mL 2，6-DCIP溶液相當(dāng)于維生素C的mg數(shù)(mg/mL)；D為滴定時(shí)樣液的體積(mL)；W為被測(cè)樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 HPLC檢測(cè)條件[12]：C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱、0.1%草酸為流動(dòng)相、流速1mL/min、柱溫30℃、檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。用濃度為1mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)使用液，用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，每次進(jìn)樣20μL，對(duì)所測(cè)得圖譜的峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和分析，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算出回歸方程。

1.2.3 試劑存放時(shí)間試驗(yàn) 將維生素C標(biāo)準(zhǔn)液置于 4～6℃冰箱中，分別于0、3、6、24、48、72、96、118、142h時(shí)用HPLC法檢測(cè)維生素C標(biāo)準(zhǔn)液中維生素C含量的變化，每處理重復(fù)3次；將2，6-DCIP溶液存放于4～6℃冰箱中，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16d時(shí)用維生素C標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定2，6-DCIP溶液，檢測(cè)t值的變化。

1.2.4 待測(cè)液存放條件試驗(yàn) 將待測(cè)液避光分別存放于室溫和4～6℃冰箱中，于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、8、16、24h時(shí)分別采用2，6-DCIP法和HPLC法檢測(cè)維生素C含量。

1.2.5 提取劑選擇試驗(yàn) 分別用1%、2%、3%的草酸溶液、偏磷酸溶液、醋酸溶液作為提取劑在同一條件下進(jìn)行提取，對(duì)提取液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測(cè)維生素C含量。

1.2.6 提取方法優(yōu)化試驗(yàn) 以2%草酸為提取劑與樣品混合打成勻漿，取等量勻漿于7個(gè)100mL容量瓶中，用2%草酸定容，分別置于室溫下震蕩0、5、10、15min，及在超聲波清洗儀中超聲[13]5、10、15min，處理后立即過(guò)濾，濾液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測(cè)維生素C含量。

1.2.7 活性炭用量試驗(yàn) 以質(zhì)量比1∶1稱取草莓樣品與2%草酸混合，迅速搗碎成漿，轉(zhuǎn)移到250mL容量瓶中定容，搖勻后各取30mL置于7個(gè)離心管中，分別加入活性炭0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、3.0g，搖勻后于10 000r/min離心機(jī)中低溫離心15min，取上清液分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測(cè)維生素C含量。

③點(diǎn)E與點(diǎn)C運(yùn)動(dòng)的路線有什么關(guān)系？(平行且相等)由此你發(fā)現(xiàn)了什么？(如圖3，四邊形AEE′C′是平行四邊形)

1.2.8 精密度試驗(yàn) HPLC法的精密度[14]試驗(yàn)用1mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)檢測(cè)6次(每次進(jìn)樣15μL)，檢測(cè)維生素C色譜峰保留時(shí)間和峰面積，計(jì)算RSD值。2，6-DCIP法[15]的精密度試驗(yàn)用2，6-DCIP溶液滴定0.02mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液，重復(fù)滴定6次(每次10mL)，記錄消耗2，6-DCIP溶液的體積并算出T值，計(jì)算RSD值。

1.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同批次樣品相同處理方法，分別用2，6-DCIP法和HPLC法檢測(cè)維生素C含量，重復(fù)5次。

1.2.10 加標(biāo)回收試驗(yàn)[16]在樣品勻漿中，分別加入0.2mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1mL，然后提取、脫色后分別用2，6-DCIP法和HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算維生素C測(cè)定值和加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測(cè)條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見(jiàn)，維生素C含量檢測(cè)所得圖譜保留時(shí)間適宜，峰形良好，說(shuō)明檢測(cè)條件設(shè)置得當(dāng)。圖2表明，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=46 116x+173.26，R2為0.999 2。

圖1 不同濃度維生素C標(biāo)準(zhǔn)液HPLC檢測(cè)圖譜

圖2 HPLC法測(cè)定維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 試劑存放時(shí)間對(duì)含量的影響

由圖3、圖4可見(jiàn)，存放于4～6℃冰箱中的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液及2，6-DCIP溶液均隨存放時(shí)間的增長(zhǎng)含量降低。其中，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在0～48h之內(nèi)變化不大，超過(guò)48h后維生素C含量急劇降低；2，6-DCIP溶液在0～12d內(nèi)t值降低較小，超過(guò)12d后t值急劇下降。說(shuō)明配制的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃下可保存48h，超過(guò)48h不可作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行試驗(yàn)，配制的2，6-DCIP溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用。

圖3 不同存放時(shí)間對(duì)維生素C標(biāo)準(zhǔn)液含量的影響

圖4 不同存放時(shí)間對(duì)2，6-DCIP溶液的影響

2.3 待測(cè)液樣存放條件對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

表1表明，待測(cè)液室溫和低溫存放，都隨存放時(shí)間增長(zhǎng)，維生素C含量降低，室溫存放比低溫存放降低幅度大。經(jīng)多重比較得知，在室溫下存放0.5h，待測(cè)液中維生素C含量即顯著降低，低溫存放1.5h內(nèi)待測(cè)液中維生素C含量差異不顯著。HPLC法檢測(cè)所得維生素C含量均高于2，6-DCIP法檢測(cè)結(jié)果。說(shuō)明待測(cè)液制備完成后應(yīng)立即測(cè)定，若無(wú)法立即測(cè)定，應(yīng)置于低溫保存，時(shí)間不超過(guò)1.5h。

圖5顯示，草酸及醋酸的濃度對(duì)維生素C的提取影響較大，2種酸均以2%提取效果最佳，偏磷酸的濃度對(duì)維生素C的提取影響較小。3%的草酸及醋酸使得2種檢測(cè)方法的結(jié)果均出現(xiàn)較大差異，說(shuō)明酸濃度過(guò)高不利于檢測(cè)，2%草酸提取效果最佳。

2.5 提取方法優(yōu)化

常溫振蕩提取和超聲波提取都會(huì)隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而使測(cè)定值下降(圖6)，其中超聲波提取5min內(nèi)，維生素C含量降低幅度較小，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果差異不大。說(shuō)明樣品加提取液勻漿后應(yīng)迅速定容、過(guò)濾和檢測(cè)。

表1 不同存放條件下樣品待測(cè)液維生素C含量 單位：mg/100g

注：表中字母是多重比較的字母標(biāo)記法，采用最小顯著性差異法(LSD)計(jì)算，顯著性水平0.05。

圖5 不同提取劑對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響

圖6 不同提取方法對(duì)維生素含量的影響

2.6 活性炭用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

由圖7可見(jiàn)，樣品中不添加活性炭時(shí)，2，6-DCIP法無(wú)法測(cè)出樣品中維生素C含量，隨著活性炭添加量的增加，測(cè)得的維生素C含量逐漸降低，添加量低于0.4g/30mL時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果幾乎無(wú)影響，超過(guò)則使檢測(cè)結(jié)果大幅度降低，兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異。說(shuō)明使用2，6-DCIP法檢測(cè)樣品中維生素C含量時(shí)必須使用低于0.4g/30mL的活性炭對(duì)樣本進(jìn)行脫色，使用HPLC法檢測(cè)樣品中維生素C含量時(shí)可不進(jìn)行脫色處理。

圖7 活性炭用量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.7 檢測(cè)方法精密度比較

由表2可見(jiàn)，HPLC檢測(cè)維生素C標(biāo)準(zhǔn)液的保留時(shí)間RSD為0.13%，峰面積RSD為0.43%；2，6-DCIP法滴定維生素C標(biāo)準(zhǔn)液消耗2，6-DCIP溶液體積RSD為1.44%、t值RSD為1.43%，說(shuō)明2種檢測(cè)方法精密度均能夠滿足測(cè)定要求，HPLC法精密度高于2，6-DCIP法。

表2 2種檢測(cè)方法精密度比較

2.8 檢測(cè)方法重復(fù)性比較

由表3可見(jiàn)，采用2，6-DCIP法5次滴定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.68%、HPLC法5次檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.56%，2種方法測(cè)定草莓維生素C含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，方法重復(fù)性好，說(shuō)明2種檢測(cè)方法均適用于檢測(cè)樣品中維生素C含量。

表3 檢測(cè)方法重復(fù)性比較

2.9 2種檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率

表4表明，HPLC法的回收率在99%～104.1%之間、2，6-DCIP法的回收率在95.7%～100.2%之間，說(shuō)明2種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表4 2種檢測(cè)方法加標(biāo)回收率

3 結(jié)論與討論

目前最常用的維生素C檢測(cè)方法為2，6-二氯靛酚鈉滴定法和高效液相色譜法，本文對(duì)這2種檢測(cè)方法具體操作過(guò)程中涉及到的檢測(cè)條件的設(shè)置、試劑及樣液的保存時(shí)間、提取劑及濃度的選擇、提取過(guò)程、脫色劑用量及2種檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性和加標(biāo)回收率等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行了比較，得出以下結(jié)論。

(1)HPLC檢測(cè)設(shè)置C18(5μm，4.6×250mm)色譜柱，0.1%草酸為流動(dòng)相，流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，所得圖譜保留時(shí)間適宜，峰形良好，維生素C標(biāo)準(zhǔn)液濃度在0.025～0.3mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=46 116x+173.26，R2為0.999 2，說(shuō)明檢測(cè)條件設(shè)置得當(dāng)。(2)配制的維生素C標(biāo)準(zhǔn)液在4～6℃下可保存48h，超過(guò)48h不可作為標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行試驗(yàn)，配制的2，6-DCIP溶液在4～6℃保存下應(yīng)在12d內(nèi)使用。待測(cè)液制備完成后應(yīng)立即測(cè)定，若無(wú)法立即測(cè)定，應(yīng)置于低溫保存，時(shí)間不超過(guò)1.5h。(3)提取劑濃度過(guò)高使得樣品中維生素C含量測(cè)定值降低，通過(guò)比較得出2%草酸提取效果最佳。樣品加提取液勻漿后應(yīng)迅速定容、過(guò)濾和檢測(cè)，不宜放置或進(jìn)行震蕩、超聲提取。(4)活性炭可對(duì)樣品提取液進(jìn)行脫色，使用2，6-DCIP法檢測(cè)樣品中維生素C含量時(shí)需添加0.4g/30mL的活性炭對(duì)樣本進(jìn)行脫色，使用HPLC法檢測(cè)樣品中維生素C含量時(shí)可不進(jìn)行脫色處理。(5)精密度、重復(fù)性及加標(biāo)回收率試驗(yàn)均表明2種檢測(cè)方法都適用于深色果蔬維生素C含量檢測(cè)。其中HPLC法精密度高于2，6-DCIP法；2，6-DCIP法的回收率為95.7%～100.2%，平均回收率為97.95%，RSD為2.68%；HPLC法的回收率為99%～104.1%，平均回收率為101.55%，RSD為2.56%。HPLC法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重現(xiàn)性及選擇性好，無(wú)需脫色，但試驗(yàn)前期準(zhǔn)備和后期掃尾工作較為繁瑣，如配制流動(dòng)相、調(diào)試設(shè)備、做標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)完成后沖洗色譜柱等，較為費(fèi)時(shí)，且對(duì)樣品的純度要求比較高，所用儀器昂貴[16]；2，6-DCIP法所需條件簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便、快速、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，但滴定終點(diǎn)需人為判斷，較為主觀，不同的人檢測(cè)可能造成較大的結(jié)果差異，且使用脫色劑吸附色素的同時(shí)，也吸附了一定數(shù)量的維生素C，造成樣品中維生素C的損失。在實(shí)際操作過(guò)程中可根據(jù)測(cè)定要求及實(shí)際條件選擇適宜的方法。◇

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(責(zé)任編輯 李婷婷)

Optimization and Comparison of Detection Methods of Vitamin C in Dark Fruits and Vegetables

GAI Qiong-hui，WANG Chun-lin

(Longdong University，Qingyang 745000，China)

dark fruit and vegetable；strawberry；vitamin C；HPLC；2，6-DCIP

蓋瓊輝(1978— )，女，碩士，講師，研究方向：農(nóng)作物栽培、設(shè)施農(nóng)業(yè)。