姬甜麗，錢海華

兩種不同慢傳輸便秘大鼠模型構(gòu)建方法比較及對(duì)水通道蛋白的影響①

姬甜麗，錢海華

目的比較進(jìn)食含復(fù)方地芬諾酯的飼料和用復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃復(fù)制大鼠慢傳輸便秘(STC)模型的差異。方法40只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)均分為灌胃對(duì)照(A)組、灌胃(B)組、飼喂對(duì)照(C)組、飼喂(D)組。B組采用復(fù)方地芬諾酯混懸液灌胃14 d，A組用等量生理鹽水灌胃，D組進(jìn)食含有復(fù)方地芬諾酯的飼料120 d，C組進(jìn)食普通飼料。造模成功后炭墨灌胃，觀察各組腸道炭墨推進(jìn)率；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)水通道蛋白(AQP)3、AQP4蛋白含量。結(jié)果A、B組各有2只大鼠死亡。腸道炭墨推進(jìn)率D組低于B組(P＜0.05)；AQP3、AQP4蛋白水平D組均高于B組(P＜0.05)。結(jié)論進(jìn)食復(fù)方地芬諾酯飼料120 d較復(fù)方地芬諾酯灌胃14 d能夠更安全、穩(wěn)定地復(fù)制STC模型。AQP可能參與STC的發(fā)生、發(fā)展。

慢傳輸便秘；模型；水通道蛋白；大鼠

在慢傳輸便秘(slow transit constipation,STC)模型復(fù)制中，復(fù)方地芬諾酯灌胃是一種常用方式，具有耗時(shí)短、定量較精確的優(yōu)點(diǎn)。但注射器灌胃給藥，動(dòng)物感染率較高，注射劑的制作對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也較高[1]；灌胃操作增加實(shí)驗(yàn)人員被咬傷、撓傷的概率；同時(shí)操作不當(dāng)極易導(dǎo)致動(dòng)物誤吸窒息，從而增加動(dòng)物的死亡率。長(zhǎng)期進(jìn)食含有復(fù)方地芬諾酯飼料的造模方式可明顯減少以上弊端。研究證明[2]，長(zhǎng)期進(jìn)食復(fù)方地芬諾酯可明顯降低結(jié)腸動(dòng)力，減少腸道蠕動(dòng)，減慢腸道傳輸速度，從而形成便秘，且未產(chǎn)生組織學(xué)損害，比較接近STC的結(jié)腸功能狀態(tài)。

自第一個(gè)水通道蛋白(aquaporin,AQP)于1988年被Agre等發(fā)現(xiàn)[3]，關(guān)于AQP與體液轉(zhuǎn)運(yùn)之間關(guān)系的研究愈來愈多[4-8]。AQP在人體組織細(xì)胞中分布十分廣泛，是生物膜上的一種通道蛋白，通過調(diào)節(jié)生物膜的透水性，介導(dǎo)水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

STC是一種病因不明、病程冗長(zhǎng)、病情頑固的疾病，是多種疾病[9-10](肛裂、痔瘡、直腸脫垂、睡眠障礙、焦慮抑郁、老年性癡呆等)的誘發(fā)因素，甚至可以誘發(fā)心腦血管疾病，直接威脅生命[11]。AQP與STC關(guān)系密切。AQP3與結(jié)腸水液代謝有密切聯(lián)系[8,12-13]，AQP4與便秘的關(guān)系不甚明確[14]。Ma等[15]和Wang等[16]剔除小鼠結(jié)腸AQP4基因，發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸對(duì)水吸收功能下降，大便中水分明顯增多，證明AQP4在結(jié)腸的表達(dá)與結(jié)腸水分吸收有關(guān)。也有文獻(xiàn)報(bào)道[17]，AQP4在STC患者結(jié)腸中表達(dá)很少，推測(cè)AQP4對(duì)水的重吸收未起到重要作用，對(duì)STC的發(fā)生、發(fā)展影響不大。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康普通級(jí)Sprague-Dawley大鼠40只，雌、雄各半，體質(zhì)量(170±10)g。按完全隨機(jī)分組方法[18]，將大鼠分為灌胃對(duì)照組(A組)、灌胃模型組(B組)、飼喂對(duì)照組(C組)、飼喂模型組(D組)。雌、雄性大鼠分別編號(hào)1～20，從隨機(jī)數(shù)表按一定順序抄錄20個(gè)數(shù)字，分別除以4，余數(shù)1、2、3、0分別分入A、B、C、D組。如果組間大鼠數(shù)不等，則從鼠數(shù)多的組分入鼠數(shù)少的組：從隨機(jī)表任取一數(shù)字除以該組鼠數(shù)，余數(shù)對(duì)應(yīng)的動(dòng)物放入鼠數(shù)少的組，直至每組動(dòng)物數(shù)相同。

實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，每籠一只，室溫26℃，濕度45%～55%，人工光照，明暗各12 h，清潔安靜，通風(fēng)良好。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑與儀器

復(fù)方地芬諾酯片：常州康普藥業(yè)有限公司，批號(hào)1604009。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。阿拉伯樹膠：廣州南方化玻公司分裝。活性炭：杭州木材總廠，參照文獻(xiàn)[19]配置墨汁。AQP3抗體(ab125219)、AQP4抗體(ab9512)：ABCAM公司。ElivsionTMSupper即用型免疫組化試劑盒(批號(hào)1511189921)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)1508110031，20×)：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。BX41光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3 模型構(gòu)建

各組處理方案見表1。

每5天稱量體質(zhì)量。計(jì)數(shù)大鼠24 h大便，取各組大便各40粒，稱取濕重；放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)烘干，稱取干重，計(jì)算含水量。觀察造模前、造模后第1天、第7天大便計(jì)數(shù)及含水量。觀察大鼠一般情況。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大便顆粒計(jì)數(shù)減少、大便體積減小，外觀干硬，質(zhì)量較對(duì)照組小，含水量少于對(duì)照組。大鼠瘦小，毛發(fā)色澤度差。腸道炭墨推進(jìn)程度較小，結(jié)腸留存大便數(shù)較多。

表1 各組大鼠處理方法

1.4 取材

便秘模型穩(wěn)定后，停藥7 d。禁食24 h后，活性炭墨灌胃；30 min后予10%水合氯醛4.5 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖腹部，計(jì)數(shù)大鼠結(jié)腸留存大便粒數(shù)。取出幽門至回盲部上端腸道(小腸)，測(cè)量總長(zhǎng)度及被炭墨黑染長(zhǎng)度，計(jì)算炭墨推進(jìn)率。

取部分升結(jié)腸，浸泡于4%多聚甲醛。

1.5 免疫組化

升結(jié)腸切片、烤片，脫蠟至水。過氧化物酶消除，抗原修復(fù)，封閉。加AQP3、AQP4一抗孵育，清洗；加二抗，清洗；加三抗，清洗；DAB染色，清洗；蘇木素復(fù)染，清洗；脫水干燥，中性樹膠封片，拍照。每組取15張切片，用Image-pro Plus 6.0分析圖像平均光密度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件處理。計(jì)量資料以(xˉ±s)表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)符合正態(tài)性分布，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)定

A組、B組均有2只大鼠死亡，C組、D組無大鼠死亡。D組大鼠明顯瘦小，體質(zhì)量小于C組，毛發(fā)暗黃，缺乏光澤；A組、B組間無明顯差異。模型大鼠大便較其對(duì)照組數(shù)量少、體積小，干硬，兩頭尖細(xì)，含水量明顯減少。停藥7 d后與停藥1 d相比，B組大便數(shù)有非常顯著性差異(P＜0.01)；D組無顯著性差異(P＞0.05)。見表2、表3。

表2 造模前后各組24 h大便粒數(shù)比較

表3 造模前后各組大便含水量比較(g)

炭墨推進(jìn)率A組高于B組(P＜0.05)，C組明顯高于D組(P＜0.01)，且D組低于B組(P＜0.05)。結(jié)腸留存大便粒數(shù)A組少于B組(P＜0.05)，C組明顯少于D組(P＜0.01)，且D組明顯多于B組(P＜0.01)。見表4。

表4 各組腸道炭墨推進(jìn)率及存留大便粒數(shù)

2.2 免疫組化

各組均有AQP3陽性細(xì)胞，呈圓形、橢圓形褐色顆粒狀，A組、B組之間，C組、D組之間均有顯著性差異(P＜0.05)。B組、D組著色較深，分布以結(jié)腸黏膜頂部的絨毛上皮細(xì)胞為主，著色以細(xì)胞膜的頂部、基底及腔面為主，且頂部較基底、兩側(cè)膜表達(dá)多；杯狀細(xì)胞少見。D組多于B組(P＜0.05)。見表5、圖1。

AQP4在A組、C組表達(dá)較少，在B組、D組有一定表達(dá)，且以局灶表達(dá)為主。黏膜頂部高于底部，細(xì)胞基底面和腔面高于側(cè)壁，吸收細(xì)胞表達(dá)明顯而杯狀細(xì)胞無表達(dá)。D組多于B組(P＜0.05)。見表5、圖2。

表5 大鼠結(jié)腸AQP3、AQP4表達(dá)(平均光密度)

3 討論

臨床將便秘分為器質(zhì)型便秘與功能型便秘，而功能型便秘又分為4類[21-22]：STC、排便障礙型便秘、混合型便秘、正常傳輸型便秘。其中STC臨床上尤為常見[23]，以結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)、進(jìn)食后結(jié)腸高振幅推進(jìn)性收縮活動(dòng)減少為特點(diǎn)[24]，以大便干燥、排出困難、便次減少、便意缺乏為主要癥狀[25]。

復(fù)方地芬諾酯主要成分是鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品[26]。鹽酸地芬諾酯是一種阿片生物堿，為哌替啶的衍生物，能與胃腸道平滑肌上的阿片受體結(jié)合，提高張力，減緩胃腸道蠕動(dòng)；同時(shí)可直接抑制腸黏膜感受器，阻斷局部黏膜蠕動(dòng)反射，使腸內(nèi)容物運(yùn)輸減慢，從而增加腸液再吸收，具有較強(qiáng)的止瀉作用。硫酸阿托品是一種乙酰膽堿M受體阻斷劑，能抑制胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，且能降低地芬諾酯的依賴性。

大鼠自然進(jìn)食含有復(fù)方地芬諾酯的飼料，此造模方式耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)120 d，但造模完成7 d后未因停止用藥而發(fā)生大便性狀改變，表明該造模方式更穩(wěn)定。與灌胃14 d方式相比，不僅大鼠死亡率降低，且更加符合人類便秘形成的過程。本研究顯示，兩種造模方式均能復(fù)制符合STC臨床病理生理特點(diǎn)的大鼠模型，但進(jìn)食復(fù)方地芬諾酯120 d復(fù)制的便秘模型更安全、穩(wěn)定。

腸道水液代謝活躍。人體腸道每天轉(zhuǎn)運(yùn)9～10 L液體中，約8 L通過小腸吸收，約1.5 L通過結(jié)腸吸收。結(jié)腸重吸收水分主要部位在近端結(jié)腸上皮細(xì)胞，故升結(jié)腸水液代謝與便秘關(guān)系更為密切。

腸道水液代謝紊亂是STC發(fā)病的重要機(jī)制，尤其與結(jié)腸水轉(zhuǎn)運(yùn)異常相關(guān)。結(jié)腸上皮細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞旁路水轉(zhuǎn)運(yùn)受限，故跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)成為結(jié)腸水分吸收的主要途徑。AQP是跨膜通道蛋白的重要成員。哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在13種亞型，消化系統(tǒng)有9種亞型表達(dá)，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9在結(jié)腸均有表達(dá)[7,16,27-28]。

圖1 各組升結(jié)腸AQP3表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,40×)

圖2 各組升結(jié)腸AQP4表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,40×)

本研究顯示，AQP3、AQP4主要分布在近端結(jié)腸的吸收細(xì)胞而非杯狀細(xì)胞，這與結(jié)腸重吸收水的部位和細(xì)胞一致，推測(cè)表達(dá)于結(jié)腸的AQP3、AQP4是水液吸收的重要通道之一。兩種造模方式下，AQP3、AQP4表達(dá)有差異，進(jìn)食復(fù)方地芬諾酯120 d后，AQP蛋白增多，水液吸收增多，結(jié)腸蠕動(dòng)減緩，使便秘進(jìn)一步發(fā)展。

多數(shù)通便藥通便作用與AQP關(guān)系密切，AQP可能是多數(shù)通便藥物的生物學(xué)基礎(chǔ)[13]。

給予大鼠MgSO4溶液，2 h時(shí)結(jié)腸內(nèi)滲透壓達(dá)到峰值，但腹瀉不明顯；嚴(yán)重腹瀉發(fā)生在給藥后4～8 h；在給藥后2 h滲透壓最高時(shí)，AQP3表達(dá)較少，不能滿足水運(yùn)輸需求，給藥后4～8 h滲透壓雖較2 h時(shí)下降，但此時(shí)AQP3水平處于峰值，大量水分從血管運(yùn)輸至腸腔[29]。故容積性通便藥通便作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)不是升高滲透壓，而是調(diào)節(jié)AQP3的表達(dá)。

刺激性通便藥比沙可啶可直接刺激產(chǎn)生巨噬細(xì)胞，增加前列腺素E2的分泌，前列腺素E2作為旁分泌因子降低結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞AQP3表達(dá)，從而阻止水分從腸腔向血管轉(zhuǎn)移，起到通便作用。

本研究顯示，進(jìn)食復(fù)方地芬諾酯120 d構(gòu)建大鼠STC模型雖然耗時(shí)較長(zhǎng)，飼料含藥量調(diào)整頻繁，但造模結(jié)果優(yōu)于灌胃14 d造模，可以推廣于便秘的實(shí)驗(yàn)研究。AQP3、AQP4在便秘結(jié)腸高表達(dá)，主要分布于上皮細(xì)胞，維持結(jié)腸的吸收功能。AQP在STC的形成、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。針對(duì)AQP藥物靶向治療將成為治療便秘的一個(gè)新突破點(diǎn)，并已逐漸取得一定進(jìn)展[30]。

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Comparison of Two Kinds of Rat Model for Slow Transit Constipation and Expression ofAquaporins in Them

JI Tian-li,QIAN Hai-hua
The First Clinical College,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210029,China

QIAN Hai-hua.E-mail:haihuaqian@126.com

Objective To compare the rat model of slow transit constipation(STC)established with gavage or feeding compound diphenoxylate.Methods Forty Sprague-Dawley rats were randomly divided into gavage control group(A),gavage group(B),feeding control group(C)and feeding group(D)equally.Group B was given compound diphenoxylate suspension by gavage for 14 days while group A accepted isodose normal saline.Group D were given feed containing compound diphenoxylate for 120 days while group C accepted normal feed.Carbon ink was poured into stomachs to observe the propelling rate after modeling,and the content of aquaporin 3 and aquaporin 4 were detected with immunohistochemistry.Results There were two rats died in group A and group B,respectively.The carbon ink propelling rate was lower in group D than in group B(P＜0.05).Both aquaporin 3 and aquaporin 4 were more in group D than in group B(P＜0.05). Conclusion STC rat model can be established by eating diphenoxylate feed for 120 days,which is safer and more stable than that of gavage for 14 days.Aquaporins in colons may play a role in onset and development of STC.

slow transit constipation;model;aquaporin;rats

R574.62

A

1006-9771(2017)05-0529-05

2016-12-22

2017-02-13)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.05.008

[本文著錄格式]姬甜麗，錢海華.兩種不同慢傳輸便秘大鼠模型構(gòu)建方法比較及對(duì)水通道蛋白的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(5):529-533.

CITED AS:Ji TL,Qian HH.Comparison of two kinds of rat model for slow transit constipation and expression of aquaporins in them[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(5):529-533.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81573979)。

南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京市210029。作者簡(jiǎn)介：姬甜麗(1990-)，女，漢族，山西高平市人，碩士研究生，主要研究方向：中醫(yī)藥治療肛腸疾病。通訊作者：錢海華，男，江蘇蘇州市人，博士，主任中醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療肛腸疾病。E-mail: haihuaqian@126.com。