李新宇 文 平 程亞楠 董 坤 譚 墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201）

用氣質(zhì)聯(lián)譜法測定中華蜜蜂體內(nèi)保幼激素

李新宇 文 平 程亞楠 董 坤 譚 墾

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201）

保幼激素是由蜜蜂咽側(cè)體分泌出的一類高萜類化合物，在蜜蜂生長發(fā)育、變態(tài)以及生殖發(fā)育過程中扮演著重要的角色。本實驗用氣質(zhì)聯(lián)譜法檢測了中華蜜蜂1，3，5日齡幼蜂的保幼激素含量。結(jié)果表明：在各齡中華蜜蜂體內(nèi)都能檢測到JH3，且蜜蜂隨日齡增長，體內(nèi)保幼激素含量增加。

中華蜜蜂；保幼激素；氣質(zhì)聯(lián)譜法

1 引言

保幼激素 (juvenile hormone,JH)是由昆蟲咽側(cè)體分泌出的一類高萜類化合物，是節(jié)肢動物的重要內(nèi)激素，先前大量的研究表明，JH在昆蟲的生長發(fā)育、變態(tài)以及生殖器官發(fā)育過程中扮演著重要的角色[1]。

目前從昆蟲中已分離出3種具有JH活性的化合物，分別稱為JH1、JH2、JH3，它們的生理活性大不相同。其中JH3是大部分成蟲的主要激素，也是蜜蜂體內(nèi)的保幼激素成分[2]。保幼激素調(diào)節(jié)蜜蜂的變態(tài)、繁殖和行為發(fā)育，由幼蟲和成蜂食道兩側(cè)的兩個球形器官咽側(cè)體合成。咽側(cè)體和其他兩個內(nèi)分泌器官由神經(jīng)相連，腦部通過神經(jīng)內(nèi)分泌信號調(diào)節(jié)咽側(cè)體的活性。保幼激素和蛻皮激素一起控制幼蟲和蛹的成長和發(fā)育[3]。蜜蜂發(fā)育經(jīng)歷6次蛻皮，5次發(fā)生在幼蟲階段，最后一次發(fā)生在蜜蜂羽化為成蜂的時候。幼蟲蛻皮后成為更大的幼蟲或發(fā)育到蛹依賴于蛻皮激素和保幼激素的平衡。保幼激素水平的變化誘導(dǎo)幼蟲到蛹、蛹到成蜂的蛻皮發(fā)生。同時保幼激素對蜜蜂有促進雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育和調(diào)節(jié)卵黃原蛋白合成的作用[4]。保幼激素能刺激蜂王脂肪體合成卵黃原蛋白，從而促進生殖系統(tǒng)發(fā)育[5]。

JH在結(jié)構(gòu)上屬于倍半萜環(huán)氧甲基酯，是小分子親脂生理活性物質(zhì)，在生物體內(nèi)以微量形式存在，處于不斷合成和降解的動態(tài)過程中[6]。JH在成蜂體內(nèi)含量甚微，且不易與脂類物質(zhì)分離，使得在生理水平上測定JH的滴度很困難。自1934年Wigglesworth發(fā)現(xiàn)JH以后很長時間，JH主要通過結(jié)扎、器官切除和移植、生物測定等加以判斷。由于生物分析法測定的靈敏度和特異性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足要求，到20世紀(jì)70年代以后逐步發(fā)展了JH的色譜分析法(如GC/MS法)和放射免疫分析法(RIA法)[7]。但這些早期的方法操作較復(fù)雜，儀器設(shè)備要求也較高，有的還需制備衍生物，故測定有一定難度。隨著現(xiàn)代色譜技術(shù)的發(fā)展，以及毛細(xì)管柱的出現(xiàn)使得檢測下限已達到＜1 ng的水平[8]。因此理論上已完全達到測定小型昆蟲體內(nèi)JH含量的水平，使用氣質(zhì)聯(lián)譜法測定中華蜜蜂體內(nèi)JH含量變得較為簡易可行。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

中華蜜蜂樣本采自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所蜂場內(nèi)蜂群。從中選取一強群，提取子脾。待蜜蜂出房后收集到飼養(yǎng)盒中飼養(yǎng)。待到一定日齡（1，3，5日齡）時用采集瓶采集蜜蜂待用。

2.2 實驗試劑

JH3標(biāo)準(zhǔn)樣品為美國Sigma公司的產(chǎn)品。正己烷和甲醇，乙酸乙酯為國產(chǎn)分析純試劑。

2.3 實驗儀器

美國Agilent公司7890B型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測器。德國Eppendorf 22331型高速冷凍離心機，渦旋震蕩儀，離心濃縮系統(tǒng),電子天平及其他儀器。

2.4 樣品提取

取供試蜜蜂，用正己烷清洗蟲體表面雜質(zhì)，濾紙吸干水分，電子天平稱重后移入研缽中,加液氮研磨直至粉末狀。取出粉末加1.5 ml緩沖溶液，充分震蕩搖勻，再加入1 ml正己烷充分震蕩搖勻。在15000 rpm，4℃條件下離心10 min，取上清液。

2.5 分離純化

分離純化使用填充硅膠的毛細(xì)管層析柱。純化前使用離心濃縮系統(tǒng)進行濃縮,正己烷定容至 20 μl進樣。用洗脫液沖洗層析柱，并接收沖洗出來的洗脫液。

2.6 色譜條件

0.32 mm×30 m HP-5色譜柱，150℃開始升溫，然后4°C/min到200°C，20°C/min到280°C，到280℃止，進樣口溫度280℃，檢測器溫度280℃。進樣量2 μl。

3 結(jié)果與分析

3.1 全過程回收率試驗

取一定量JH標(biāo)準(zhǔn)樣品于提取液進行全過程提取處理，測得JH3回收率為96.7%。標(biāo)樣上機檢測結(jié)果表明，兩種標(biāo)樣分離效果甚佳，出峰時間重現(xiàn)性好，回收率高，表明本試驗所采取的方法可用于JH滴度測定。

3.2 中華蜜蜂體內(nèi)保幼激素含量測定

測定結(jié)果表明，中華蜜蜂像大多數(shù)昆蟲一樣，體內(nèi)含有保幼激素Ⅲ。中華蜜蜂1,3,5日齡幼蜂體內(nèi)JH3變化從1～5齡呈上升趨勢（表1）。經(jīng)質(zhì)譜檢測器的檢測結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)樣本的質(zhì)譜圖與中華蜜蜂樣本的質(zhì)譜圖一致，表明所測樣本中含有JH3這種保幼激素。

表1 不同日齡成年工蜂的保幼激素含量(單位:ng)

4 討論與結(jié)論

保幼激素在蜜蜂的生長發(fā)育、變態(tài)以及生殖發(fā)育過程中起至關(guān)重要的作用。研究結(jié)果表明，不同日齡中華蜜蜂均含有一定量的JH3，說明中華蜜蜂像大多數(shù)昆蟲種類一樣，保幼激素在其發(fā)育變態(tài)過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。檢測發(fā)現(xiàn)，同日齡的中華蜜蜂中保幼激素的含量變化有一定差異，這種變化有可能是導(dǎo)致蜜蜂不同日齡負(fù)責(zé)不同工作的原因，因此進一步開展對JH含量在蜜蜂體內(nèi)的動態(tài)變化及JH含量在蜜蜂級型分化和其他生理生化過程中的作用的研究是很有必要的。

圖1 保幼激素標(biāo)樣和蜜蜂樣本的色譜圖

GC-MS是目前公認(rèn)的JH鑒定方法，測定精度和可信度高，是JH未知種類鑒定的唯一客觀方法[9，10]。

[1]Riddiford L M.Cellular and molecular actions of juvenile hormonesⅠ.General considerations and premetamorphic actions[J]. Advances in Insect Physiology,1994,24:213-274.

[2]李乾君，龔和，管致和.昆蟲卵黃發(fā)生研究進展[J].昆蟲學(xué)報，1995,38(2):237-251.

[3]董言德，薛瑞德，趙彤言，等.保幼激素III對三帶喙庫蚊滯育發(fā)生期間卵巢濾泡和體內(nèi)RNA變化的影響 [J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，1998,9(3):161-164.

[4]周冰峰，鮑秀良，龔蜜，等.保幼激素類似物ZR-512對蜜蜂蜂王初生重的影響[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995,24(1):109-112.

[5]周冰峰，龔蜜，鮑秀良，等.保幼激素類似物ZR-512對蜜蜂蜂王胚后發(fā)育的調(diào)控作用[J].福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995,24(2):227-230.

[6]Tobe S S,Feyereisen R.Juvenile hormone biosynthesis:regulation and assay[A].//Downer R G H,Laufer H.Endocrinology of insects[M].New York:Alan R Liss,1983:161-178.

[7]楊亦樺，戴華國，韓航如，等.用HPIC測定稻褐飛虱體內(nèi)的保幼激素[J].華東昆蟲學(xué)報，1997,6(2):24-27.

[8]Edwards J P,Corbitt T S,Mcardle H F,et al.Endogenous levels of insect juvenile hormones in larval,pupal and adult stages of the tomato moth,Lacanobia oleracea[J].J.Insect Physiol.,1995,41(8): 641-651.

[9]Park Y I,Shu Shengqiang,Ramaswamy S B,et al.Mating in Heliothis virescens:transfer of juvenile hormone during copulation by male to female and stimulation of biosynthesis of endogenous juvenile hormones [J].Arch.Insect Biochem.Physiol.,1998,38(2): 100-107.

[10]Yin Chihming,Zou Baixiang,Jiang Mugeng,et al.Identification of juvenile hormone III bisepoxide(JHB3),juvenile hormone III and methyl farnesoate secreted by the corpus allatum of Phormia regina (Meigen),in vitro and function of JHB3either applied alone or as a part of a juvenoid blend [J].J.Insect Physiol.,1995,41(6): 473-479.

Determination of juvenile hormone in Apis cerana cerana by GC/MS

Li Xinyu,Wen Ping,Cheng Yanan,Dong Kun,Tan Ken

(Eastern Bee Research Institute of Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

Juvenile hormone is secreted by the bees corpus allatum of the terpenoids.Juvenile hormone on the growth and development of bees,abnormal reproductive development and plays an important role in the process.This experiment determination of juvenile hormone in Apis cerana cerana by GC/MS in 1,3,5 day age.Results show that the bees in the body can be detected JH3 in every age,and the bees along with the age growth,the juvenile hormone content in the body.

Apis cerana cerana;juvenile hormone，GC/MS

國家現(xiàn)代蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-45-kxj14）

李新宇（1989-），男，在讀碩士，主要從事蜜蜂生物學(xué)研究

譚墾，男，教授，博導(dǎo)，主要從事蜜蜂生物學(xué)研究，E-mail:eastbee@sina.com