高 沿, 胡超群, 任春華, 錢 璟, 何香燕, 江 曉, 黃 文

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凡納濱對蝦水孔蛋白-4的cDNA克隆及鹽度脅迫對其肝胰腺mRNA表達水平的影響

高 沿1, 2, 胡超群1, 任春華1, 錢 璟1, 何香燕1, 2, 江 曉1, 黃 文1

(1. 中國科學院南海海洋研究所, 中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室廣東省應用海洋生物學重點實驗室, 廣東廣州510301; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

為了探索水孔蛋白(Aquaporin, AQP)在凡納濱對蝦()滲透壓調(diào)節(jié)過程中作用, 本研究通過RACE方法獲得克隆的凡納濱對蝦(命名為)的cDNA全長序列, 并分析了鹽度脅迫對其肝胰腺mRNA表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):cDNA序列全長為1 048 bp, 其中包括75 bp的5￠UTR, 187 bp的3￠UTR和786 bp的ORF。根據(jù)ORF序列推導出編碼261個氨基酸, 預測其分子質(zhì)量為27.85 kDa, 等電點為8.11。推導的氨基酸序列與其他甲殼物種的AQP相似度為48.8%到97.3%。進化分析顯示LvAQP4屬于AQP1-like 亞族、AQP4類。定量PCR(qPCR)檢測到在不同組織中均有表達, 其中鰓的表達量最高, 肝胰腺、肌肉、腦和眼柄中也較高, 而血淋巴、腸、胃和胸神經(jīng)節(jié)中表達量則較低。在高鹽(鹽度40)刺激下, 凡納濱對蝦的肝胰腺mRNA表達量會隨著時間推移而上升, 到6 h達到最高, 而后逐步下降。而在低鹽(鹽度4)刺激下, 凡納濱對蝦的肝胰腺mRNA表達量并無明顯變化。在原代分離和培養(yǎng)的肝胰腺細胞中, 培養(yǎng)液中加入額外的NaCl會劑量依賴地提高mRNA表達水平。同樣, 通過在培養(yǎng)液中額外加入蔗糖提高培養(yǎng)液滲透壓, 也會劑量依賴地提高mRNA表達水平, 但作用不如NaCl明顯。這些結(jié)果表明鹽度與肝胰腺的表達量有關(guān)對凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)具有非常重要的作用。

凡納濱對蝦();; 鹽度脅迫; 滲透壓調(diào)節(jié)

凡納濱對蝦(), 俗稱南美白對蝦, 是一種廣鹽性的對蝦, 對鹽度的耐受范圍為0.5~40[1]。水環(huán)境中的鹽度對對蝦而言是一種重要的非生物因子, 影響著凡納濱對蝦的生長、存活、蛻皮、呼吸、繁殖、營養(yǎng)需求和對特定病原的抗性等[2-5]。在自然條件下, 凡納濱對蝦成蝦通常在高鹽度的海水中進行繁殖, 幼體則遷徙到河口處生活成長, 長成成蝦后又回到高鹽度的海水中進行繁殖[6]。在養(yǎng)殖條件下, 受降雨和蒸發(fā)的影響, 養(yǎng)殖水體鹽度在一段時間內(nèi)會急劇或緩慢的變化。面對外界環(huán)境鹽度的改變, 凡納濱對蝦會通過滲透壓調(diào)節(jié)來維持自身內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。因此了解其滲透壓調(diào)節(jié)的機制對凡納濱對蝦的健康養(yǎng)殖和自然生活周期的理解具有非常重要的意義。

在凡納濱對蝦中, 許多滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的基因已經(jīng)克隆并分析, 如Na+/K+-ATPase[7]、H+-ATPase[8]、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase, CA)[9]和Ca2+-ATPase[10]等。目前滲透壓的調(diào)節(jié)主要集中在離子調(diào)節(jié)方面, 而水調(diào)節(jié)的研究比較缺乏。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)水的快速運輸需要水孔蛋白(Aquaporin, AQP)的協(xié)助[11]。AQP是一種以同源四聚體形式存在的膜蛋白, 每個單體都有一個MIP結(jié)構(gòu)域, 6個跨膜區(qū)域(TM1-6)和5個環(huán)形結(jié)構(gòu) (LoopA-E),其中LoopB和LoopE疏水強, A環(huán)、C環(huán)、E環(huán)位于質(zhì)膜外側(cè), B環(huán)、D環(huán)、C端、N端位于質(zhì)膜內(nèi)側(cè), B環(huán)、D環(huán)上都有一段保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸(Asn-Pro-Ala, NPA)基序, 這兩段NPA基序在空間上并列, 這對形成AQP的“沙漏”模型非常重要[12-13]。到目前為止, 在人類中已經(jīng)隆了13種AQP[14], 在其他物種也發(fā)現(xiàn)與人類同源的AQP, Soto等[15]根據(jù)AQP氨基酸序列相似性, 將其分為4個亞族: a. AQP1-like亞族, 包含AQP0、AQP1、AQP2、AQP4、AQP5和AQP6 6類基因, 這一亞族對水分子轉(zhuǎn)運具有高度選擇性, 為傳統(tǒng)的水孔蛋白; b.AQP3-like亞族, 包含AQP3、AQP7、AQP9和AQP10 4類基因, 這一家族除了轉(zhuǎn)運水外, 還轉(zhuǎn)運甘油、尿素等小分子, 稱為水甘油通道蛋白(aquaglyceroporins); c.AQP8-like亞族, 只包括AQP8一類基因; d.AQP11-like亞族, 包含AQP11和AQP12兩類, 又稱為超級水孔蛋白(superaquporins)。然而, 由于絕大部分哺乳動物陸生, 并沒有通過體表與外界交喚水分子的滲透壓調(diào)節(jié)機制, 因此AQP在適應外界水環(huán)境中鹽度變化的研究還相對比較缺乏。相反在水生生物中, AQP會在滲透壓調(diào)節(jié)中起到非常重要的作用, 但目前研究主要集中在硬骨魚類[16-20], 而在甲殼動物, 尤其是重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種對蝦中, 研究則比較缺乏。肝胰腺是對蝦的物質(zhì)代謝中心, 其含有大量的離子轉(zhuǎn)運酶、解毒酶及抗逆酶等, 是凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)的一個重要器官。而目前鹽度對AQP影響的研究主要集中在鰓和腸等器官, 而其在肝胰腺的表達和作用模式研究則比較缺乏。

本研究從凡納濱對蝦中獲得一個AQP()的cDNA全長序列并對其進行生物信息學分析, 同時分析了高鹽、低鹽對活體肝胰腺以及不同濃度NaCl和蔗糖對離體肝胰腺細胞中mRNA表達的影響, 為進一步研究凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的凡納濱對蝦(體質(zhì)量約10 g)來源于廣東省湛江市東方實業(yè)有限公司凡納濱對蝦良種養(yǎng)殖基地。實驗前將室外養(yǎng)殖的凡納濱對蝦移至室內(nèi)圓桶內(nèi)暫養(yǎng)一周, 暫養(yǎng)期間海水鹽度為32, 24 h充氣, 每天定時投3次料, 每天換水1/3。

1.2基因克隆

用TRIzol試劑從鰓組織中提取總RNA(Invitrogen)并用PrimeScriptTMII 1stStrand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)進行第一條鏈cDNA的合成。全長cDNA利用SMATRerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech)獲得。5￠/3￠-RACE的特異性引物是根據(jù)Genbank的部分cDNA部分序列來設(shè)計(ID: KF548550), 5￠-RACE 特異性引物為GSP5和GSPn5 (表1), 3￠-RACE特異性引物為GSP3和GSPn3(表1)。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖進行電泳并用PCR purification Kit (TaKaRa)進行切膠純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD19-T vector (TaKaRa)連接, 然后轉(zhuǎn)化到cells JM109(TaKaRa)。重組子根據(jù)藍白斑進行篩選并測序。

表1 實驗中用的引物

1.3 生物信息學分析

利用BioEdit軟件尋找ORF并翻譯成蛋白質(zhì), LvAQP4結(jié)構(gòu)域的預測利用在線的SMART(http: //smart.embl-heidelberg.de/), 等電點、分子質(zhì)量預測和疏水性分析利用在線的Protscale (http: //web.expasy.org/protscale/)。從NCBI檢索不同物種的AQP序列并利用Clustalx 1.8軟件進行多序列比對。用Mega 6軟件構(gòu)建進化樹, 參數(shù)為Neighbour- Joining method (pairwise deletion), protein difference (p distance), bootstrap (1000)。

1.4 組織分布與高鹽、低鹽刺激

隨機從5尾對蝦中取鰓、肌肉、腦、眼柄、肝胰腺、血淋巴、腸、胃和胸神經(jīng)節(jié)組織并立即放入液氮中保存, 作組織分布檢測用。

將在鹽度32的海水中暫養(yǎng)的對蝦隨機放到鹽度4(低鹽)和鹽度40(高鹽)的海水中進行急性鹽度刺激, 在1.5、3、6、12和24 h分別取肝胰腺組織樣品, 并立即放到液氮中保存作后續(xù)定量PCR用。

1.5 對蝦肝胰腺細胞分離與孵育

凡納濱對蝦肝胰腺細胞的分離根據(jù)先前描述的方法[21], 即取10尾凡納濱對蝦的肝胰腺, 用無Ca2+/Mg2+的HBSS溶液洗3次(Sigma), 然后用含EDTA(1 mmol/L)的無Ca2+/Mg2+的HBSS溶液孵育5 min,隨后肝胰腺的殘片用含膠原酶IV(1 mg/mL, Sigma)和DNaseII (0.01 mg/mL, Sigma)的無Ca2+/Mg2+的HBSS溶液在28℃孵育30 min, 孵育后用吸管輕輕吹打, 然后用30mm的篩網(wǎng)過濾肝胰腺細胞, 過濾后的肝胰腺細胞培養(yǎng)液在4℃ 100 × g 離心5 min, 去上清并收集沉底的肝胰腺細胞。獲得的肝胰腺原代細胞在Dulbecco modified Eagle medium , DMEM)/F-12 (1︰1, GibcoBRL, USA)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。將細胞稀釋到0.4′106個/mL, 然后轉(zhuǎn)移到24孔的聚乙烯亞胺預涂板上, 在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

分離的肝胰腺細胞培養(yǎng)24 h后, 用額外添加不同濃度的NaCl (50、100、200、300、400 mmol/L)和蔗糖(100、200、400、600、800 mmol/L)的DMEM/F-12培養(yǎng)液進行刺激培養(yǎng), 刺激6 h后收集細胞并進行后續(xù)分析。

1.6 實時定量PCR

按照1.2方法進行提取不同組織、活體實驗高鹽、低鹽刺激肝胰腺樣品和離體肝胰腺細胞孵育樣品的總RNA, 并進行第一條鏈cDNA的合成。的mRNA表達水平利用實時定量PCR(qPCR)進行檢測。利用SYBR Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑盒和RotorGene RG-3000 real-time PCR System (Corbett Research)進行定量分析。qPCR中的特異性引物序列為為F1和R1 (表1)并利用β-actin作為內(nèi)參基因, 序列為為b- actinF和b-actinR (表1)。每個樣本做3個重復, 反應程序為95℃ 60 s預變性, 接著95℃ 15 s變性, 60℃ 30 s復性, 72℃ 40 s延伸40個循環(huán)并在72℃進行信號獲取。的相對表達量利用2–??Ct方法進行處理和分析。數(shù)據(jù)用SPSS17.0單因素方差分析處理(ANOVA)。

2 結(jié)果

2.1cDNA克隆與結(jié)構(gòu)分析

克隆到的4 cDNA全長為1048 bp (Genbnak登錄號KU497721), 其中包括75 bp的5￠UTR, 187 bp的3￠UTR和786 bp的ORF(圖1)。根據(jù)ORF序列推導出LvAQP4含261個氨基酸, 分子質(zhì)量為27.85 kDa, 等電點為8.11。預測LvAQP4的MIP結(jié)構(gòu)域位于16~234 AA位置處, 6個跨膜區(qū)域分別在25~45 AA, 56~74 AA, 101~139 AA, 145~163 AA, 177~189 AA和218~238 AA位置處, 在83~85 AA及198~201 AA位置處有兩個保守的NPA基序, 分別位于LoopB和LoopE。

推導的氨基酸序列放在相應的ORF下面。MIP結(jié)構(gòu)域用灰色表示。起始密碼子和終止密碼子加粗表示, “*”. 終止密碼子, “”. 加尾信號, “”. 跨膜區(qū), 方框. NPA基序

The amino acid sequence deduced from ORF is presented along with the corresponding cDNA sequence, the MIP domain is marked by gray, the start and stop codons (asterisk) are in boldface, the polyadenylation signal (AATAA) is double-underlined, probable transmembrane regions are underlined, and two NPA motifs are boxed

2.2 多序列比對及進化分析

LvAQP4與其他物種的AQP的比較結(jié)果見圖2。LvAQP4與斑節(jié)對蝦(), 羅氏沼蝦(), 三疣梭子蟹()和魚虱()的AQP相似性分別為97.3%、73.9%、63.3%和48.8%。多序列比對發(fā)現(xiàn)它們都具有兩個保守的NPA基序, 6個跨膜區(qū)域。

N-J進化樹進化分析表明(圖3), LvAQP4屬于AQP1-like亞家族、AQP4類, 屬于一種傳統(tǒng)的水通道蛋白。AQP4類分為脊椎動物與無脊椎動物兩類, LvAQP4與無脊椎動物的AQP聚為一類, 其中LvAQP4與斑節(jié)對蝦的AQP的遺傳距離最小, 進化關(guān)系最近。

保守性強的區(qū)域用黑表示, 保守性低的區(qū)域用灰色表示。NPA基序用方框表示

The conserved amino acid residues are in black shadow and similar amino acid residues are in gray shadow. NPA motif is shown in a box

2.3組織表達分布

qPCR檢測到在不同組織中均有表達(圖4), 在這些組織中, 鰓中的表達量最高, 其次為肌肉、腦、眼柄和肝胰腺, 而在血淋巴、腸、胃和胸神經(jīng)節(jié)中表達量則較低。

2.4 鹽度刺激下肝胰腺表達量的變化

在高鹽刺激下(圖5A), 凡納濱對蝦肝胰腺中mRNA表達水平隨著刺激時間的延長而逐步上升, 在刺激后1.5 h表達量就顯著上升(<0.05), 在3和6 h組表達量較對照組有極其顯著性上升(< 0.01), 其中在6 h表達量達到最高, 為對照組的4.83倍, 而刺激后的3和6 h兩時間點之間表達量無顯著變化(>0.05)。在高鹽刺激后12 h, 凡納濱對蝦肝胰腺中mRNA表達水平又下降到與對照組水平(>0.05)。而在低鹽刺激下(圖5B), 凡納濱對蝦肝胰腺中mRNA表達水平在各時間點與對照組相比均無顯著性差異(>0.05)。

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤; Gi.鰓; Hp.肝胰腺; Ms.肌肉; Hc.血細胞; In.腸; Br.腦; Es.眼柄; St.胃; TG.胸神經(jīng)節(jié)

Data were presented as mean±S.E.; Gi. Gill; Hp. Hepatopancreas; Ms. Muscle; Hc. Hemocyte; In. Intestine; Br. Brain; Es. Eyestalk; St. Stomach; TG. Thoracic ganglion

2.5 高滲透壓對肝胰腺原代細胞表達量的影響

本研究采取加入NaCl(圖6B)和蔗糖(圖6C)兩種方法提高細胞培養(yǎng)液的滲透壓, 來研究高滲透壓對mRNA表達水平的影響。在額外添加NaCl的實驗中發(fā)現(xiàn), 隨著額外添加NaCl濃度的提高,mRNA總體上出現(xiàn)劑量依賴的表達量提升。當額外添加的NaCl濃度在100 mmol/L及以下時,mRNA的表達量無顯著變化(>0.05)。當額外添加的NaCl濃度在200 mmol/L及以上時,mRNA的表達量隨著NaCl濃度的升高而顯著增加(<0.05), 呈現(xiàn)出明顯的劑量效應。

在額外添加蔗糖的實驗中同樣發(fā)現(xiàn), 隨著額外添加蔗糖濃度的提高mRNA表達量會有提升。當額外添加的蔗糖質(zhì)量濃度在100 mmol/L以下時,mRNA的表達量無顯著變化(> 0.05)。當額外添加的NaCl濃度在200 mmol/L及以上時,mRNA的表達量較對照組而顯著增加(< 0.05), 但200 mmol/L及以上組之間的mRNA表達量無顯著變化(> 0.05)。而在400 mmol/L的NaCl或800 mmol/L的蔗糖等滲的情況下, 加入NaCl組mRNA的表達水平為對照組的2.34倍, 而蔗糖組只有對照組的1.53倍, NaCl比蔗糖對mRNA表達的提升作用更明顯。

“*”.< 0.05; “**”.< 0.01

A. 新鮮分離的原代細胞與培養(yǎng)后的細胞; B. 不同濃度NaCl對肝胰腺原代細胞mRNA表達水平的影響; C. 不同濃度蔗糖對肝胰腺原代細胞mRNA表達水平的影響; 不同字母表示組間差異顯著(< 0.05), 相同字母表示組間差異不顯著(> 0.05)

A. Fresh isolated and cultured primary cells; B. Dose-dependent effects of sodium chloride onmRNA expression in hepatopancreatic primary cells; C. Dose-dependent effects of sucrose onmRNA expression in hepatopancreatic primary culture cells, Different letters indicate significant differences (< 0.05); same letters indicate no significant differences (> 0.05)

3 討論

該研究采用RACE技術(shù)獲得了cDNA全長序列, 其ORF長度為786 bp, 預測編碼261個氨基酸, 分子質(zhì)量為27.85 kDa。編碼的蛋白質(zhì)LvAQP4與其他AQP結(jié)構(gòu)一樣[12], 都有一個典型的MIP結(jié)構(gòu)域, 6個跨膜區(qū)域和5個連接環(huán)。在LvAQP4中發(fā)現(xiàn)兩個保守的NPA基序, 第一個NPA基序上游為VSGCH, 第二個NPA基序第一個氨基酸為R, 第二個氨基酸不是D, 這是傳統(tǒng)AQP中所常見的序列結(jié)構(gòu)[22], 這表明LvAQP4屬于傳統(tǒng)AQP, 傳統(tǒng)AQP是一類對水分子轉(zhuǎn)運具有高度選擇性的水孔蛋白。NJ進化分析進一步表明LvAQP4屬于傳統(tǒng)的AQP、AQP1-like亞族AQP4類。多序列比對分析顯示LvAQP4與其他甲殼動物的AQP相似度為48.8%~ 97.3%, 這表明LvAQP4具有相對保守性。水孔蛋白是一個多基因家族, 目前在哺乳動物種已經(jīng)克隆出13種[14], 在魚類已經(jīng)克隆出7種[16], 香港牡蠣()中已經(jīng)克隆出10種[23], 在秀麗隱桿線蟲()發(fā)現(xiàn)了8種[24]。而目前凡納濱對蝦只有本研究的同源基因一種, 凡納濱對蝦中是否存在更多未知的水孔蛋白基因需要進一步研究。

本研究對在不同組織中的表達水平進行了定量分析。結(jié)果顯示, 與其他物種中觀察到的類似[19, 23],在凡納濱對蝦不同組織中也是廣泛表達的, 這表明對凡納濱對蝦的生理功能具有非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)在這些組織中, 鰓的表達量最高, 在尖吻角鯊()[19]和香港牡蠣[23]中同樣發(fā)現(xiàn)在其鰓中表達量比其他組織明顯高, 這可能與鰓是最重要的滲透壓調(diào)節(jié)器官有關(guān)[25-26]。而在肌肉、腦、眼柄和肝胰腺中,mRNA的表達量也較高。肝胰腺也是滲透壓調(diào)節(jié)的重要器官, 面對外界鹽度脅迫的壓力時, 凡納濱對蝦會改變消化酶的活性為血淋巴進行滲透壓調(diào)節(jié)提供能量[27]。

在體外活體實驗中發(fā)現(xiàn), 在高鹽刺激下凡納濱對蝦肝胰腺中mRNA表達水平隨著刺激時間的延長而逐步上升, 在6 h表達量達到最高, 為對照組的4.83倍, 隨后在12 h表達量又下降到對照組水平。而在低鹽刺激下, 凡納濱對蝦肝胰腺中mRNA表達水平較對照組均無顯著變化。而在同屬甲殼動物的三疣梭子蟹中卻發(fā)現(xiàn)不同的結(jié)果, 在高鹽(鹽度45)刺激后的3 h, 三疣梭子蟹肝胰腺mRNA開始下降, 直到72 h 才恢復到刺激前水平。在低鹽(鹽度11)刺激后的前3 h表達量無顯著變化, 在6 h和24 h表達量顯著下降, 直到24 h表達量才顯著上升, 隨后又顯著下降, 直到72 h還未恢復到刺激前水平[28]。凡納濱對蝦與三疣梭子蟹水孔蛋白受高低鹽刺激后有不同的表達水平, 這可能與它們具有不同的滲透壓調(diào)節(jié)類型有關(guān)[29]。凡納濱對蝦是強的滲透壓調(diào)節(jié)者, 可以在淡水中長期生活, 而三疣梭子蟹是弱的滲透壓調(diào)節(jié)者, 其生長需在一定的鹽度水域中, 不能在淡水中存活。由于強和弱的滲透壓調(diào)節(jié)者受鹽度刺激時, 有不同的離子轉(zhuǎn)運酶來進行離子轉(zhuǎn)運, 離子濃度的變化從而引起滲透壓的改變, 最終影響凡納濱對蝦與三疣梭子蟹水孔蛋白有不同的表達水平。

在分離的肝胰腺原代細胞中進一步證實了高滲刺激會使的表達量升高。在額外添加NaCl和蔗糖的細胞培養(yǎng)液中, 隨著額外加入的NaCl和蔗糖濃度的提高,mRNA表達量均會出現(xiàn)劑量依賴的提升。這表明高滲誘導的表達是一個直接的細胞反應, 而不需要內(nèi)分泌因子調(diào)控。此外, 等滲NaCl和蔗糖下,表達量上有差異, 這表明兩個可能存在不同的反應機制。在哺乳動物中離體實驗中, 高滲條件使離體的老鼠星狀膠質(zhì)細胞的表達量升高[30], 但在人的視網(wǎng)膜色素上皮細胞系中卻又發(fā)現(xiàn)高滲條件會造成表達量的下降[31], 這表明的表達水平在不同的物種不同的細胞之間有顯著性差異。

凡納濱對蝦滲透壓調(diào)節(jié)是一個復雜的過程, 在面對外界鹽度的變化, 凡納濱對蝦會從個體、組織到分子水平的一系列適應性調(diào)整, 以適應外界環(huán)境鹽度的變化。在分子調(diào)節(jié)方面, 主要由兩部分組成, 即離子的調(diào)節(jié)和水的調(diào)節(jié)。目前, 在凡納濱對蝦中已經(jīng)分析了許多離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的酶[7-10], 并證明它們在滲透壓調(diào)節(jié)方面的作用, 而水的調(diào)節(jié)研究還比較缺乏。在魚類中發(fā)現(xiàn)幫助水運輸?shù)乃椎鞍讓B透壓調(diào)壓具有非常重要的作用[16-20], 并且是不同的水孔蛋白相互合作來進行滲透壓的調(diào)節(jié)。在對舌齒鱸()[17]的研究中發(fā)現(xiàn), 不同鹽度下和具有不同的表達模式, 在高鹽條件下在腎和腸中表達量比在低鹽中高, 而在鰓中表達量幾乎相同, 因為在高鹽條件下, 對舌齒鱸通過腸上皮進行水的吸收和腎的重吸收來補償體內(nèi)水份的丟失; 而在低鹽條件下,在鰓的表達量比在高鹽條件下顯著升高, 而在腎和腸中幾乎都沒有表達, 因為在低鹽的調(diào)節(jié)下, 對舌齒鱸通過鰓的將外界的水運輸?shù)窖馨? 而不需要腸上皮進行水的吸收和腎進行水的重吸收。水孔蛋白家族是一個多基因家族,凡納濱對蝦中可能同樣存在其他的水孔蛋白, 在不同的鹽度下, 通過調(diào)節(jié)不同水孔蛋白的表達來參與滲透壓調(diào)節(jié), 使個體能夠適應外界鹽度的變化。

在對凡納濱對蝦研究中發(fā)現(xiàn)不同的鹽度下,有著不同表達水平, 這表明有著不同的調(diào)節(jié)機制。已有的研究發(fā)現(xiàn)AQP的調(diào)節(jié)有兩種機制: 第一種是控制AQP的磷酸化和去磷酸化來控制AQP的活性, 但這種機制只在某些植物和微生物中發(fā)現(xiàn)[32], 在動物中尚未有這樣的調(diào)節(jié)機制的報道。第二種是控制單位面積細胞膜的AQP的量。直接的方法就是通過增加或降低基因的表達和蛋白質(zhì)的合成和降解[33]。間接方法的是通過AQP的易位調(diào)節(jié), 其中研究最廣泛的哺乳動物的AQP2, 抗利尿激素通過受體來調(diào)節(jié)AQP的位置, 從而進行調(diào)節(jié)水孔蛋白[34]。在凡納濱對蝦肝胰腺中發(fā)現(xiàn), 高滲會導致mRNA表達水平的變化, 這暗示高滲條件下凡納濱肝胰腺LvAQP4可能是通過控制基因的表達量來調(diào)節(jié)水的運輸。而在低滲條件下,mRNA表達無顯著變化, 這可能是因為低滲對凡納濱肝胰腺LvAQP4無影響或者低滲會引起LvAQP4通過易位來調(diào)節(jié)水的運輸。了解的調(diào)節(jié)機制, 對了解凡納濱對蝦的水分運輸及滲透壓調(diào)節(jié)機制具有非常重要的意義。目前調(diào)節(jié)機制尚不明確, 需要以后的進一步的研究。

本研究首次獲得了的cDNA全長序列, 并分析了高鹽、低鹽對活體肝胰腺mRNA及不同濃度NaCl和蔗糖對離體肝胰腺細胞mRNA表達的影響。這是在對蝦中首個對進行的研究。由于凡納濱對蝦中可能存在更多的水孔蛋白基因, 所以在后續(xù)研究中, 需要發(fā)掘更多的水孔蛋白基因, 并結(jié)合離子調(diào)節(jié)與自由氨基酸調(diào)節(jié)機理的研究, 進一步闡釋凡納濱對蝦的滲透壓調(diào)節(jié)機制。

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Molecular cloning of aquaporin-4 () gene in the Pacific white shrimp()and the effect of salinity stress on its expression in hepatopancreas

GAO Yan1, 2, HU Chao-qun1, REN Chun-hua1, QIAN Jing1, HE Xiang-yan1, 2, JIANG Xiao1, HUANG Wen1

(1. CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology/Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Marine Biology, South China Sea Institute of Oceanology, Guangzhou 510301, China; 2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

In this study, to explore the function of aquaporin (AQP) in the osmoregulation of, the full-length cDNA ofaquaporin-4 (termed as) was cloned by RACE method, and the effect of salinity stress on the transcriptional expression ofwas 1048 bp in length, containing a 75 bp 5￠UTR, a 187 bp 3￠UTR, and a 786 bp ORF that encode for a deduced protein of 261 amino acids with the estimated molecular mass of 27.85 kDa and an isoelectric point of 8.11. The LvAQP4 protein shared identities from 48.8% to 97.3% with its counterparts in other decapod species. Additionally, the phylogenetic analysis suggested that LvAQP4 belonged to AQP1-like subfamily and clustered with other AQP4s. Quantitative real-time PCR (qPCR) showed that the expression ofwas ubiquitous, with the highest expression in the gills. The expression levels ofwere also high in the hepatopancreas, muscle, brain, and eyestalk but low in hemocytes, intestine, stomach, and thoracic ganglion. Under hypersalinity stress(40), the expression levels ofmRNA in the hepatopancreas increased consistently from the beginning to 6 h, reaching the highest level at 6 h, and then decreased after that. Under hypersalinity stress (4), on the contrary, the mRNA levels ofshowed no significant change. In the hepatopancreatic primary cells, the expression levels ofmRNA exhibited a dose-dependent upregulation when increased dosage of NaCl was added. Similar results were observed with addition of sucrose in the culture medium to increase the osmotic pressure, but the effect of sucrose ontranscripts was weaker than that with NaCl. These results suggested that the expression ofhepatopancreas was affected by salinity andmay play important roles in the osmoregulation of.

;; salinity stress; osmoregulation

S917.4

A

1000-3096(2017)02-0061-10

10.11759//hykx20160201003

2016-02-01;

2016-05-24

廣東省中國科學院全面戰(zhàn)略合作專項(2013B091300020); 廣東省省級科技計劃項目(2014B030301064, 2015B020231007); 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(“863”計劃)(2012AA10A404-4)

高沿(1990-), 男, 安徽安慶人, 碩士研究生, 主要從事對蝦繁育與增養(yǎng)殖工作, 電話: 15521216043, E-mail: gaoyan13@mails.ucas.ac.cn; 胡超群, 通信作者, 研究員, E-mail: hucq@scsio.ac.cn

Feb. 1, 2016

[The Comprehensive Strategic Cooperation Project of The Chinese Academy of Sciences of Guangdong Province, No.2013B091300020; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, China, No.2014B030301064, 2015B020231007; National High-tech Research & Development of China (“863” program), No.2012AA10A404-4]

(本文編輯: 譚雪靜)