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        合并人類免疫缺陷病毒感染的乙型肝炎患者YMDD自然變異研究

        2017-05-24 14:46:44蔣忠勝胡家光溫小鳳蒙達禮劉志娟
        中國全科醫(yī)學 2017年14期
        關鍵詞:乙型肝炎變異測序

        蔣忠勝,胡家光,溫小鳳,張 鵬,蒙達禮,劉志娟,柯 柳,覃 川

        ·論著·

        合并人類免疫缺陷病毒感染的乙型肝炎患者YMDD自然變異研究

        蔣忠勝*,胡家光,溫小鳳,張 鵬,蒙達禮,劉志娟,柯 柳,覃 川

        目的 觀察合并人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的乙型肝炎患者在高效抗反轉錄病毒治療(HAART)前是否存在YMDD自然變異。方法 選取2013年6月—2016年6月在廣西柳州市人民醫(yī)院感染病科治療的合并HIV感染的乙型肝炎患者80例為研究對象,在接受HAART前采集血清,采用基因直接測序法進行YMDD檢測。結果 對80例合并HIV感染的乙型肝炎患者檢測,未發(fā)現(xiàn)YMDD自然變異。結論 經(jīng)基因直接測序,未發(fā)現(xiàn)未經(jīng)HAART的合并HIV感染的乙型肝炎患者存在YMDD自然變異。限于檢測方法的靈敏度,有待于采用高靈敏度的檢測方法進一步研究。

        乙型肝炎;HIV;YMDD變異;藥物耐受性

        蔣忠勝,胡家光,溫小鳳,等.合并人類免疫缺陷病毒感染的乙型肝炎患者YMDD自然變異研究[J].中國全科醫(yī)學,2017,20(14):1680-1683.[www.chinagp.net]

        JIANG Z S,HU J G,WEN X F,et al.Natural YMDD mutations in HBV/HIV co-infected patients[J].Chinese General Practice,2017,20(14):1680-1683.

        由于乙型肝炎病毒(HBV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)具有相同的傳播途徑,在HIV的流行區(qū)有5%~10%的HIV感染者合并HBV感染[1],我國的廣東地區(qū)HIV感染者中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性率高達9.5%(266/2 793)[2]。高效抗反轉錄病毒治療(HAART)方案中拉米夫定(3TC)是合并HIV感染的乙型肝炎患者的骨干治療藥物[3],但3TC為低耐藥基因屏障藥物,在長期使用過程中HBV會出現(xiàn)酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酶(YMDD)變異,治療后1年耐藥率為14%~32%,4年累積耐藥率達70%[4]。不僅如此,近年研究顯示,未經(jīng)3TC治療的HBV感染者體內也可檢出YMDD基因變異毒株(YMDD自然變異毒株),且檢出率達10%~30%[5-7]。而對合并HIV感染的乙型肝炎患者是否存在YMDD自然變異,目前國內外相關研究較少。本研究通過檢測合并HIV感染的乙型肝炎患者YMDD自然變異,為乙型肝炎患者的治療提供依據(jù)。

        1 對象與方法

        1.1 病例納入與排除標準 納入標準:符合中華醫(yī)學會頒布的《艾滋病診療指南(2011版)》[8]及《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[9]的診斷標準。排除標準:(1)合并丙型、甲型、戊型肝炎;(2)單純HIV感染或獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS);(3)在接受HAART前采用口服核(苷)酸類抗HBV藥物。

        1.3 方法

        1.3.1 主要試劑與儀器 HBV核酸定量檢測試劑盒及配套試劑購自廣東華銀醫(yī)藥科技有限公司;PCR DSMIX購自廣州東盛生物科技有限公司;PCR上機八排管購自美國Axygen公司;臺式高速冷凍離心機(TGL-16)購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;超低溫冰箱(MDF-U333)購自日本SANYO公司;單面工作超凈臺(SW-CJ-2FD)購自蘇州凈化設備有限公司;DYY-6C電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。

        1.3.2 標本處理 取患者晨起空腹外周靜脈血共10 ml,其中5 ml于當日檢測肝功能、HBV DNA和乙型肝炎血清標志物(HBVM);另5 ml經(jīng)8 000×g離心5 min,取上清液于-80 ℃冰箱中保存。

        1.3.3 HBV DNA提取 用移液器取50 μl血清加到滅菌EP管中,加入200 μl核酸抽提液A,用移液器上下吹打約30次,室溫靜置3 min。加入200 μl核酸抽提液B,顛倒混勻后以13 000×g離心10 min。棄上清液,加入200 μl核酸抽提液C,顛倒混勻后以13 000×g離心5 min。棄上清液,晾干后加入20 μl雙蒸水溶解,置于-20 ℃保存。

        1.3.4 基因變異位點檢測 采用巢式PCR進行目的條帶擴增。外輪引物PrimerF1序列:5′-CATCCTGCTGCTATGCCTCATC -3′,PrimerR1序列:5′-TTGCCGRGCAACGGGGTAAAGG-3′;內輪引物PrimerF2序列:5′-GTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTA-3′,PrimerR2序列:5′-TGACATACTTTCCAATCAATAGGYC-3′,引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。巢式PCR外輪反應體系25 μl,包括ddH2O 8.5 μl,PCR MIX 12.5 μl,15 pmol/μl PrimerF1和PrimerR1各1 μl,DNA模板2 μl,反應參數(shù):94 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸A尾1 min,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。巢式PCR內輪反應體系25 μl,包括ddH2O 8.5 μl,PCR MIX 12.5 μl,15 pmol/μl PrimerF2和PrimerR2各1 μl,DNA模板2 μl,反應參數(shù):94 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸A尾1 min,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。先進行外輪PCR擴增,然后進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,有目的條帶則進行下一步測序處理,無目的條帶則進行內輪擴增,擴增出的目的片段送華大基因經(jīng)純化后進行測序,并進行測序結果分析。

        2 結果

        58例患者檢測到編碼rtL180的堿基突變,堿基突變均為C→T,但所編碼的氨基酸不變;各患者均未檢測到編碼rtM204的堿基突變,即80例患者均未發(fā)現(xiàn)YMDD自然變異。

        3 討論

        全球有4 000萬慢性HBV感染者,每年因乙型肝炎相關性肝硬化和肝癌導致的死亡達(50~75)萬例[10],以干擾素和核苷(酸)類似物為代表的抗病毒治療是治療CHB最有效的方法,其中3TC是全世界首個在臨床應用的核苷(酸)類抗病毒藥物。大量的研究證實,3TC能有效抑制HBV的復制,增加HBeAg轉陰率和乙型肝炎e抗體(HBeAb)血清轉換率,恢復肝功能,改善肝組織學[11],由于其療效確切、價格低廉,目前仍在我國廣泛使用[6]。但是,長時間的3TC治療可誘發(fā)YMDD變異,使HBV對3TC耐藥[4]。不僅如此,越來越多的證據(jù)認為,CHB患者存在YMDD自然變異的現(xiàn)象,發(fā)生率為0~31.58%[6]。張為民等[12]對144例未經(jīng)抗病毒治療的CHB患者研究發(fā)現(xiàn),30例出現(xiàn)YMDD自然變異,變異檢出率為20.8%,其中YIDD陽性19例(63.3%),YVDD陽性8例(26.7%),YIDD與YVDD均陽性3例(10.0%)。彭瑛等[13]對90例未使用過3TC的CHB患者研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生YIDD變異6例(6.7%),YVDD變異24例(26.7%),YIDD與YVDD均變異6例(6.7%)。殷先堯等[14]采用引物特異性實時熒光PCR對51例未進行抗HBV治療的CHB患者進行檢測,發(fā)現(xiàn)YMDD自然變異毒株檢出率為25.5%(13/51)。目前關于HBV發(fā)生YMDD自然變異的原因,多數(shù)學者較認同選擇學說。HBV復制過程中前基因組RNA反轉錄為負鏈DNA期間,反轉錄酶缺乏自然校正的功能,難以糾正核苷酸變異,即CHB患者機體內外部的一些因素導致HBV基因突變,生物的選擇作用使得患者感染的HBV本身已經(jīng)發(fā)生變異,當機體免疫系統(tǒng)對已感染的野生株HBV產(chǎn)生強力的特異性免疫應答后,野生株HBV的復制被抑制,變異株逃逸形成抗病毒免疫力,從劣勢株逐漸成為優(yōu)勢株[15]。

        但是,也有部分研究發(fā)現(xiàn),在未經(jīng)任何抗病毒藥物治療的無癥狀HBV攜帶者中未發(fā)現(xiàn)YMDD變異,如TAUSEEF等[16]對巴基斯坦未使用3TC治療的CHB患者應用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)檢測,未發(fā)現(xiàn)有YMDD自然變異;RAMEZANI等[17]對伊朗77例未使用3TC治療的CHB患者應用PCR-RFLP檢測,同樣未發(fā)現(xiàn)有YMDD自然變異。

        梁欣[18]對使用含3TC的HAART的39例HIV與HBV合并感染者采用PCR反向點雜交法檢測,發(fā)現(xiàn)YMDD變異檢出率達41%,隨著治療時間的延長,YMDD變異的檢出率逐漸增加,治療6~12、12~24、24~36個月時YMDD檢出率分別為10.0%、42.1%、70.0%。蘭青等[19]對20例合并HIV感染的乙型肝炎患者在HAART過程檢出YMDD變異8例,檢出率為40%,其中YIDD變異2例,YVDD變異6例,且均伴rtL180M位點變異。表明在合并HIV感染的乙型肝炎患者中,YMDD變異率較高。但是,國內尚未見合并HIV感染的乙型肝炎患者基線YMDD變異的研究。

        本研究經(jīng)基因直接測序,未發(fā)現(xiàn)未經(jīng)HAART的合并HIV感染的乙型肝炎患者存在YMDD自然變異。該結論有待擴大樣本量,采取更敏感的基因檢測方法進一步驗證。

        作者貢獻:蔣忠勝、胡家光進行文章的構思與設計;胡家光進行研究的實施與可行性分析,并進行結果的分析與解釋;張鵬、蒙達禮、劉志娟、柯柳、覃川進行數(shù)據(jù)收集、整理;蔣忠勝撰寫論文,對文章整體負責,監(jiān)督管理;胡家光、溫小鳳進行論文的修訂。

        本文無利益沖突。

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        (本文編輯:吳立波)

        Natural YMDD Mutations in HBV/HIV Co-infected Patients

        JIANGZhong-sheng*,HUJia-guang,WENXiao-feng,ZHANGPeng,MENGDa-li,LIUZhi-juan,KELiu,QINChuan

        DepartmentofInfectiousDiseases,LiuzhouGeneralHospital,Liuzhou545006,China*Correspondingauthor:JIANGZhong-sheng,Chiefphysician;E-mail:jiangzs1111@126.com

        Objective To investigate whether there are natural tyrosine-methionine-aspartate-aspartate (YMDD) mutations in patients with hepatitis B virus(HBV) and HIV co-infection before receiving the highly active antiretroviral therapy(HAART).Methods The participants enrolled in this study were 80 patients with HIV and HBV co-infection treated in Department of Infectious Diseases,Guangxi Liuzhou General Hospital from June 2013 to June 2016.Direct sequencing was used to detect the status of YMDD in the HBV DNA polymerase gene in the serum of the patients before receiving the HAART.Results No natural YMDD mutations were found in these patients.Conclusion The natural YMDD mutations are not found in HBV and HIV co-infection patients before receiving the HAART by direct sequencing.But this result needs to be further confirmed by the method with higher sensitivity.

        Hepatitis B;HIV;YMDD mutation;Drug tolerance

        廣西自然科學基金資助項目(2013GXNSFAA019213)

        R 373.21

        A

        10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.006

        2016-12-26;

        2017-03-13)

        545006廣西柳州市人民醫(yī)院感染病科

        *通信作者:蔣忠勝,主任醫(yī)師;E-mail:jiangzs1111@126.com

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