邵 波

（浙江樹人大學，浙江 杭州 310015）

實驗室與分析

離子色譜測定殼寡糖聚合度研究

邵 波

（浙江樹人大學，浙江 杭州 310015）

采用離子色譜方法研究殼寡糖聚合度（DP）與其保留因子（k’）的相關關系。利用實驗數(shù)據(jù)建立線性回歸方程，并對樣品中的未知殼寡糖樣品的聚合度進行分析，并改變流速和淋洗液的條件進行驗證，誤差 ≤1.97。因此，可以利用離子色譜分離保留因子計算殼寡糖的聚合度。

殼寡糖；保留因子；聚合度

近年來，殼寡糖逐漸應用于食品、醫(yī)藥、飼料、農(nóng)業(yè)等各領域[1]。目前殼寡糖產(chǎn)品檢測中聚合度的分析尤為關鍵，但是其檢測的方法尚不成熟。常用檢測方法有液相色譜法[2]、毛細管電泳法[3-4]及費時的衍生熒光法。離子色譜積分脈沖安培檢測法是報道的檢測糖類最好的方法[5]，但這些方法都需要使用標準品進行驗證[6]，殼寡糖的標準樣品不但價格昂貴，且供應商極少因而較難購全，這給殼寡糖聚合度的驗證帶來很大的困難。根據(jù)色譜中保留值規(guī)律，通過實驗研究其聚合度與保留因子之間的關系非常有意義，可以在缺乏標準品的情況下，對未知的殼寡糖進行聚合度的分析，以獲得高活性殼寡糖產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

戴安DX-600離子色譜儀：配電化學檢測器，分析柱系統(tǒng)為CarboPac PA10 4mm×50mm，保護柱為CarboPacPA10 4mm×250 mm。

殼2～殼6糖標準物質(zhì)（含量大于90%）。超純水(18.2MΩ)。殼寡糖試樣。

1.2 實驗方法

殼寡糖標準混合液：分別稱取殼2～殼6糖的標準物質(zhì)各10.00mg用超純水分別溶解于10mL容量瓶中定容，配成濃度為1.0 mg·mL-1的儲備液。使用液分別用超純水稀釋至10μg·mL-1。

殼寡糖樣品溶液：稱取殼寡糖樣品1.0g，用超純水溶解后定容至10mL，用0.45μm水性濾膜過濾，濾液作為儲備液備用，使用時用超純水稀釋至10μg·mL-1。

1.3 色譜條件

色譜柱及檢測池溫度20℃，進樣量25μL，ED40A電化學檢測器配 Au工作電極及Ag-AgCl 參比電極，積分脈沖安培法檢測。

淋洗液1：A：100 mmol·L-1氫氧化鈉；B：超純水；20%A+80%B(V/V) 等度洗脫。

淋洗液2：A：100 mmol·L-1氫氧化鈉；B：超純水；10%A+90%B(V/V) 等度洗脫。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 殼寡糖聚合度與保留因子的計算

取殼寡糖樣品溶液適當稀釋后進樣分析，流速0.60mL·min-1，淋洗液：20%NaOH+80%H2O(V/V)，得到圖1的色譜圖。圖1所示1～3號峰為未知聚合度殼寡糖，4～8號峰則使用標準物質(zhì)進行定性確證，分別為殼6～殼2糖。計算保留指數(shù)及相關參數(shù)見表1。

圖1 殼寡糖樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of Chitosan Oligosaccharide sample

根據(jù)氣相色譜的碳數(shù)規(guī)律，同系物的調(diào)整保留時間或保留因子（K′）的對數(shù)與碳數(shù)存在線性關系：logk′=A1n+B1，式中，k′為保留因子，A1為碳數(shù)規(guī)律常數(shù)，B1為常數(shù)，n為碳數(shù)值。直鏈殼寡糖是由氨基葡萄糖單體縮合而成的寡糖，其中的聚合度（DP）等同于碳數(shù)，但是由于鏈上有氨基，通過對殼寡糖聚合度DP與保留因子k′相關關系進行回歸，發(fā)現(xiàn)聚合度DP與保留因子對數(shù)logk′具有指數(shù)相關關系。

2.2 未知峰聚合度的計算

先由表1的數(shù)據(jù)建立聚合度為2～6的殼寡糖對照品的logDP與logk′的相關關系。研究中發(fā)現(xiàn)，殼寡糖的保留值規(guī)律為：logk′=A1logDP+B1，將3號未知峰的logk′值數(shù)據(jù)代入上述方程，計算其“l(fā)ogDP”值，并由此“l(fā)ogDP”值計算其“DP”值及誤差值。完成對該未知峰的定性后，為避免誤差，再以該未知峰為最高聚合度，順序向下建立新的回歸方程，直至完成所有未知峰的聚合度計算。由計算可知，該樣品中1～3個未知峰分別對應聚合度為11、9、7的殼寡糖。

表1 殼寡糖聚合度（DP）與保留因子（k′）數(shù)據(jù)計算Table 1 Data calculation of oligosaccharide polymerization degree (DP) and retention fator (k′)

表2 聚合度及誤差計算Table 2 Calculation of (DP) and deviation with 15%NaOH+85%H2O(V/V) elution

表3 殼寡糖對照品聚合度DP與保留因子k′數(shù)據(jù)計算Table 3 Data calculation of (DP) and retention fator (k′)

2.3 改變流速及淋洗條件的影響

將流速改變?yōu)?.80mL·min-1，淋洗液10% NaOH+90% H2O(V/V)等度洗脫，分離后的各項參數(shù)見表3和表4。保留因子的對數(shù)與聚合度的對數(shù)之間的線性關系依然存在。

表4 聚合度確定及其誤差計算Table 4 Calculation of DP and deviation with 5%NaOH+95%H2O(V/V) elution

3 結(jié)論

實驗表明，低聚殼寡糖聚合度的對數(shù)與保留因子的對數(shù)具有線性關系。根據(jù)建立的關系對殼寡糖樣品進行聚合度的分析，改變流速和淋洗液比例后，誤差不大于1.97%，可見該法可以在缺少相應的殼寡糖標準試劑時對其進行定性，以保證產(chǎn)品的生產(chǎn)質(zhì)量和品質(zhì)，可廣泛運用于各行業(yè)的殼寡糖聚合度的檢測。

[1] 馬鏑，吳元華，趙秀香.殼寡糖的制備、分離分析方法及在農(nóng)業(yè)上的應用[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2007(2)：1-5.

[2] Krokeide,I.M., Synstad.B., Gaseidnes.S., et al. Natural substrate assay for chitinases using high-performance liquid chromatography: a comparison with existing assays[J]. Anal. Biochem., 2007, 363: 128-134.

[3] ElRassi, Z. Recent developments in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of carbohydrate species[J]. Electrophoresis, 1999, 20: 3134-3144.

[4] Lee.K.B., Kim.Y.S., Linhardt.R.J. Capillary zone electrophoresis for the quantitation of oligosaccharides formed through the action of chitinase[J]. Electrophoresis, 1991(12): 636-640.

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[6] 陳梅蘭，林智威，盧珩俊，邵波.離子色譜分離保留因子計算定性分析低聚殼寡糖的研究[J].藥物分析雜志，2017，37(1)：43-49.

[7] 陳金玲，黃雪松.薄層色譜法快速檢測大蒜低聚果糖[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2012，39(9)：103-105.

[8] 熊建飛，周光明，許麗，等. 離子色譜法測定奶粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖[J].食品科學，2012(8)：176-179.

Determination of Polymerization Degree of Chitosan Oligosaccharide by Ion Chromatography

SHAO Bo
(Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China)

The relationship between the degree of polymerization ( DP ) of chitosan oligosaccharide and retention factor ( k ’ ) was studied by ion chromatography. The polymerization of unknown chitosan oligosaccharide samples was analyzed by using the experimental data to establish the linear regression equation and changing velocity and eluent conditions to verificate the method by error less than 1.97. Therefore, the retention factor could be separated by ion chromatography to calculate the degree of polymerization of chitosan oligosaccharide.

chitosan oligosaccharide; retaining factors; degree of polymerization

O 652.63

A

1671-9905(2017)05-0035-03

浙江省分析測試科技計劃項目（編號2015C37039）

邵波，女，碩士，高級實驗師，主持省分析測試基金、省教育廳、杭州市科委課題，參與國家級省級課題多項，發(fā)表論文30余篇，其中核心刊物20余篇，數(shù)篇文章被SCI、CA收錄

2017-03-06