栗 亮， 高 原

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室， 廣東 珠海 519090; 2. 棗莊職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 山東 棗莊 277800)

大鼠正中視前核注射血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)對(duì)某些腎臟功能指標(biāo)的影響*

栗 亮1,2， 高 原1△

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)生理學(xué)教研室， 廣東 珠海 519090; 2. 棗莊職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 山東 棗莊 277800)

目的：探討大鼠正中視前核注射血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)對(duì)某些腎臟功能指標(biāo)的影響。方法：健康雄性SD大鼠56只隨機(jī)分為4組(n=14):①人工腦脊液組：正中視前核(MnPO)先注射人工腦脊液(aCSF)0.25 μl，20 min后再注射0.25 μl，②血管緊張素Ⅱ組:MnPO先注射aCSF 0.25 μl，20 min后再注射內(nèi)含20 ng血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)溶液0.25 μl，③洛沙坦預(yù)處理組：MnPO先注射內(nèi)含5 μg洛沙坦(Losartan)溶液0.25 μl，20 min后再注射20 ng血管緊張素Ⅱ溶液0.25 μl，④洛沙坦組：MnPO先注射內(nèi)含5 μg洛沙坦溶液0.25 μl，20 min后再注射aCSF 0.25 μl。每組取7只大鼠在注射前、注射后20 min、40 min、60 min、120 min檢測(cè)尿鈉濃度，另7只大鼠注射1 h后處死動(dòng)物，取腎臟，檢測(cè)各組大鼠腎組織一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性。結(jié)果：52只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析，與人工腦脊液組相比，血管緊張素Ⅱ組腎臟NO與NOS活性升高，1 h腎排鈉量明顯升高；與洛沙坦預(yù)處理組相比，血管緊張素Ⅱ組腎臟NO與NOS活性升高，1 h腎排鈉量也明顯升高。結(jié)論：AngⅡ作用于MnPO后，腎促鈉排泄反應(yīng)增強(qiáng)，腎皮質(zhì)NO水平升高，NOS活性增強(qiáng)，洛沙坦預(yù)處理可下調(diào)AngⅡ在腎臟誘導(dǎo)的上述變化。

正中視前核；血管緊張素Ⅱ；一氧化氮；一氧化氮合酶；大鼠

MnPO； angiotensinⅡ； NO； NOS； rat

【DOI】 10.12047/j.cjap.5360.2017.009

水、電解質(zhì)的中樞調(diào)節(jié)一直是一個(gè)重要的生理學(xué)問題。腦內(nèi)的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)可介導(dǎo)飲水行為、嗜鈉、和排鈉利尿等效應(yīng)[1]。Pereira da Silva等在清醒大鼠觀察到，在正中視前核(median preoptic nucleus, MnPO)微量注射AngⅡ，通過AT1介導(dǎo)，不僅誘發(fā)動(dòng)物的飲水和嗜鹽行為，而且引發(fā)顯著的排鈉利尿效應(yīng)。但在正中視前核(median preoptic nucleus, MnPO)，由AT1受體介導(dǎo)的促鈉排泄反應(yīng)的途徑與腎皮質(zhì)一氧化氮(nitric oxide， NO)及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性變化的影響報(bào)道較少。

本文在麻醉大鼠的MnPO微量注射AngⅡ，或預(yù)先注射AT1受體拮抗劑洛沙坦(Losarten)后再注射AngⅡ，檢測(cè)排鈉反應(yīng)和腎組織NO與NOS活性變化，試圖探討MnPO注射AngⅡ或洛沙坦對(duì)腎排鈉量的影響。觀察MnPO注射AngⅡ后腎組織NO與NOS活性變化。用洛沙坦阻斷腦AT1受體后腎組織NO與NOS活性變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

56只雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用合格證號(hào)SCXK(粵)2007-0011]。

1.2 藥物與試劑

AngiotensinⅡ(美國Sigmag公司)；Losartan(美國默沙東公司)；一氧化氮檢測(cè)試劑盒、一氧化氮合酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；尿鈉試劑盒(上海滬震實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SD大鼠56只隨機(jī)分為4組(n=14):(1)人工腦脊液組:MnPO先注射人工腦脊液(artificial cerebro spinal fluid,aCSF)0.25 μl，20 min后再注射0.25 μl；(2)血管緊張素Ⅱ組:MnPO先注射aCSF 0.25 μl，20 min后再注射內(nèi)含20 ng血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)溶液0.25 μl；(3)洛沙坦預(yù)處理組：MnPO先注射內(nèi)含5 μg洛沙坦(Losartan)溶液0.25 μl，20 min后再注射20 ng血管緊張素Ⅱ溶液0.25 μl；(4)洛沙坦組：MnPO先注射內(nèi)含5 μg洛沙坦溶液0.25 μl，20 min后再注射aCSF 0.25 μl。每組取7只大鼠在注射前、注射后20 min、40 min、60 min、120 min檢測(cè)尿鈉濃度，另7只大鼠注射1 h后處死動(dòng)物，取腎臟，檢測(cè)各組大鼠腎組織NO含量和NOS活性。aCSF(mmol/L)：NaCl 120，NaH2PO41.5，NaHCO326，MgSO41.4，KCl 4，CaCl21.5，葡萄糖10，溶于1 000 ml的重蒸水中，pH值調(diào)制7.4。

1.3.2 注射位點(diǎn)的確認(rèn) 心臟顯露，快速灌注50 ml生理鹽水，后灌注多聚甲醛的固定液400 ml，隨即剪下大鼠頭，打開顱腔，固定鼠腦，連續(xù)振蕩切片，克紫染色，脫水、透明、封固。判斷注射位點(diǎn)(圖1)，不準(zhǔn)確拋棄。

1.3.3 尿鈉濃度測(cè)定 麻醉，分離一側(cè)頸外靜脈，靜滴補(bǔ)充丟失體液。分離另一側(cè)頸總動(dòng)脈插管，測(cè)定血壓和心率。行雙側(cè)的輸尿管插管收集尿液，待血壓、心率穩(wěn)定后，收集尿液1次，MnPO分別給藥，注射后20 min、40 min、60 min、120 min收集尿液，按照說明書測(cè)定尿Na+含量。

1.3.4 一氧化氮和合酶活性測(cè)定 另外28只大鼠MnPO微量注射AngⅡ1 h后，取一腎，用眼科剪盡快剪碎組織塊(在冰水浴中進(jìn)行)。在玻璃勻漿器中進(jìn)行研磨勻漿，低溫低速離心機(jī)4℃，2 000 r/min離心10 min，按照說明書測(cè)定一氧化氮和合酶活性。

Fig. 1 Median preoptic nucleus histological sections Nissl image A: MnPO of coronal histological sections panograma map; B: Glass micro-tube was used of located in the MnPO,arrow pointing to the anchor point; MnPO: Median preoptic nucleus

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 注射位點(diǎn)的確認(rèn)

觀察切片，根據(jù)針道尖端位置判斷注射位點(diǎn)(圖1B)，棄去4只注射位點(diǎn)不準(zhǔn)確大鼠，余52只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終各組大鼠為aCSF組(n=12)、AngⅡ組(n=13)、洛沙坦預(yù)處理組(n=14)和洛沙坦組(n=13)。

2.2 MnPO注入AngⅡ?qū)δI排鈉的影響

aCSF組和洛沙坦組注射前與注射后120 min內(nèi)排鈉量基本平穩(wěn)。AngⅡ組注射后21～40 min排鈉量達(dá)到高峰，與aCSF組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。洛沙坦預(yù)處理組注射后21～40 min內(nèi)的排鈉量明顯低于AngⅡ組(P<0.05)。洛沙坦預(yù)處理組注射后21-40 min內(nèi)的排鈉量仍高于aCSF組(P<0.05，表1)。

2.3 MnPO注入AngⅡ?qū)δI組織NO水平及其合酶活性的影響

AngⅡ組腎皮質(zhì)NO和NOS活性均明顯高于人工腦脊液組(P<0.05，P<0.01)；洛沙坦預(yù)處理組腎皮質(zhì)NO水平和NOS活性均明顯低于AngⅡ組(P<0.01)；洛沙坦組腎皮質(zhì)NO水平和NOS活性均明顯低于AngⅡ組(P<0.01)；但洛沙坦預(yù)處理與洛沙坦比較，腎皮質(zhì)NO和NOS水平無明顯差異(表2)。

GroupnBefore1～20min21～40min41～60min61～120minA61.23±0.681.31±0.461.24±0.511.29±0.491.30±0.53B61.27±0.573.01±0.434.78±0.56*2.41±0.521.35±0.48C71.37±0.521.65±0.412.43±0.76#2.02±0.471.32±0.51D61.28±0.601.29±0.371.32±0.53#1.30±0.461.29±0.49

A： aCSF group； B： AngⅡgroup； C： Losartan pretreatment group； D： Losartan group; aCSF: Artificial cerebro spinal fluid

*P<0.05vsA group;##P<0.05vsB group

GroupnNO(μmol/g)NOS(u/mg.prot)A60.96±0.170.21±0.19B71.39±0.20**0.25±0.20*C71.06±0.19##0.21±0.23##D71.10±0.17##0.20±0.17##

A: aCSF group; B: AngⅡgroup; C: Losartanpretrea tment group; D: Losartan group; NO: Nitric oxide; NOS: Nitricoxide synthase; aCSF: Artificial cerebro spinal fluid

*P<0.05,**P<0.01vsA group;###P<0.01vsB group

3 討論

MnP0位于第三腦室的前壁,與調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡的終板血管器、室旁核、視上核等核團(tuán)有密切聯(lián)系[2，3]。腦內(nèi)存在獨(dú)立的腎素-血管緊張素系統(tǒng)；該系統(tǒng)可以誘發(fā)動(dòng)物的嗜鹽、飲水行為，還有排鈉利尿效應(yīng)，因此中樞的AngⅡ在水、鹽平衡的調(diào)節(jié)中具有重要的作用[4]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到大鼠MnPO注射AngⅡ引起顯著的促鈉排泄反應(yīng)，給予洛沙坦可減輕排鈉反應(yīng)。提示腦內(nèi)AT1受體可能參與AngⅡ刺激引起的促鈉排泄反應(yīng)。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)觀察到MnPO注射AngⅡ后1 h，腎皮質(zhì)NO含量升高及其合酶活性明顯增強(qiáng)，表明MnPO注射AngⅡ可增強(qiáng)腎NO含量及其合酶活性。Pablo報(bào)道在腎動(dòng)脈使用NO可增加尿鈉濃度[5]，提示腎臟的NO及其合酶可能參與腦內(nèi)AngⅡ引發(fā)的腎臟排鈉反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)洛沙坦預(yù)處理后明顯降低了腦內(nèi)MnPO部位注射AngⅡ引發(fā)的腎臟NO水平及其合酶活性，提示腦血管緊張素能AT1受體參與了MnPO注射AngⅡ引起的促鈉排泄反應(yīng)。在人類，腎小管上皮細(xì)胞在含AngⅡ的細(xì)胞液內(nèi)被孵育，可能是通過增加環(huán)磷酸鳥苷水平這一機(jī)制使一氧化氮隨時(shí)間一劑量依賴性的增加釋放?；谏鲜鍪聦?shí)，我們推測(cè)MnPO注射AngⅡ與腦血管緊張素能AT1受體相結(jié)合，通過某種神經(jīng)體液機(jī)制激活了腎皮質(zhì)內(nèi)的NOS，使NO合成增多，促進(jìn)腎排鈉反應(yīng)。

Linas and Repine[6]觀察原代培養(yǎng)的鼠腎近端小管上皮細(xì)胞中，由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO抑制了基底膜的鈉流和鈉泵的活性，Liang and Knox[7]發(fā)現(xiàn)在從負(fù)鼠腎細(xì)胞分離的囊泡中加入硝普鹽(外源性NO供體)能夠降低鈉泵活性。在髓袢升支粗段細(xì)胞系，NO通過限制Na+泵α1-亞單位的基因表達(dá)降低Na+泵的活性[8]。在遠(yuǎn)端腎單位，NO可直接抑制集合管對(duì)鈉的重吸收和水的滲透[8]。給人類腎灌注L-精氨酸(NO的前體)可以使NO合成增多，尿鈉排泄也增多。因此結(jié)合本實(shí)驗(yàn)推測(cè)腎小管上皮細(xì)胞能夠合成NO，激活鳥苷酸環(huán)化酶，提高環(huán)磷酸鳥苷水平[9]，進(jìn)而抑制近曲小管上皮細(xì)胞Na+泵活性[5]，減少NaCl的重吸收，尿鈉增多。

一氧化氮及其合酶參與腎排鈉排水的機(jī)制很復(fù)雜，還可能有中樞或(和)外周其他物質(zhì)參與，具體的生理機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31160214)

2015-09-10 【修回日期】2016-06-20

R363

A

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