王亞美 魏原杰 艾新宇 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

棉蚜His-CYP6J1融合蛋白的分離純化及多克隆抗體的制備

王亞美 魏原杰 艾新宇 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

通過親和層析法純化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白，制備及鑒定其多克隆抗體。采用鎳離子金屬螯合親和層析柱分離純化棉蚜His-CYP6J1融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)純化產(chǎn)物。用純化得到的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠，制備抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體；采用ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)；免疫組化法檢測(cè)抗血清特異性。結(jié)果表明，純化的His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠后得到多抗血清，ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)1∶200 000。免疫組化結(jié)果顯示，此多克隆抗體能夠與棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特異性結(jié)合，卻在棉鈴蟲沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的結(jié)合反應(yīng)。上述結(jié)果對(duì)研究棉蚜單一P450蛋白結(jié)構(gòu)、功能及其在棉蚜抗藥性形成過程的作用奠定基礎(chǔ)。

P450 CYP6J1融合蛋白；蛋白純化；多克隆抗體

細(xì)胞色素P450（CYP450）是一類血紅素鐵結(jié)合蛋白的超家族［1］，它能夠參與內(nèi)源性物質(zhì)以及包含藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝［2］。該家族成員在生物、化學(xué)催化反應(yīng)過程中具有的高度特異性使其在化工、環(huán)保及藥物代謝等范圍都具有極大的應(yīng)用價(jià)值，從而成為生物及生化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在細(xì)胞中，細(xì)胞色素P450主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上［3］，在哺乳類動(dòng)物中主要存在于微粒體和線粒體中。細(xì)胞色素P450酶系存在的范圍很廣泛，包括動(dòng)物、植物、昆蟲等［4］。但在昆蟲中的中腸、脂肪體等器官中的細(xì)胞色素P450酶系的表達(dá)量較高［5］。據(jù)報(bào)道已經(jīng)克隆到的昆蟲P450家族的基因超過了1 000 個(gè)［6］。由于P450家族的多樣性，這也決定了其功能的多樣性，因此在提高昆蟲對(duì)內(nèi)外有毒物質(zhì)代謝、寄主的適應(yīng)性等方面都發(fā)揮著重要的作用［7］。

棉蚜（Aphis gossypii Glover）是一種世界性農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)最重要的害蟲之一。棉蚜，又稱瓜蚜，屬于半翅目蚜科蚜屬，它是一種雜食性害蟲，繁殖能力很高，寄主范圍廣泛，棉蚜有孤雌生殖和兩性生殖兩種方式。棉蚜是以韌皮部汁液為食的刺吸式昆蟲，在取食的同時(shí)，它會(huì)傳播某些植物病毒［8］而對(duì)農(nóng)作物造成巨大的傷害［9］。目前，棉蚜的防治主要依賴于化學(xué)防治，隨著各類殺蟲劑的大量和不科學(xué)使用，導(dǎo)致棉蚜的抗藥性發(fā)展較快，進(jìn)而使其抗性機(jī)制復(fù)雜化［10］，有文獻(xiàn)報(bào)道稱棉蚜可以通過改變自身的習(xí)性和行為逃避減少藥劑的接觸量［11］，這對(duì)棉蚜的防治帶來了巨大的困難。自1964年龔坤元等首次報(bào)道棉蚜對(duì)藥物的抗性增加之后［12］，陸續(xù)涌現(xiàn)對(duì)棉蚜抗藥性機(jī)制的研究報(bào)道，其中參與棉蚜藥物抗性的主要物質(zhì)有乙酰膽堿酯酶［13-16］、羧酸酯酶等［17，18］。酯酶活性的增加或酯酶的敏感性降低都可以導(dǎo)致棉蚜對(duì)部分殺蟲劑的抗性增加。但是，通過解毒酶細(xì)胞色素P450單加氧酶參與的抗性也是最常見的類型［19-22］。研究表明，棉蚜抗性品系的細(xì)胞色素 P450s的活性顯著高于敏感品系，說明細(xì)胞色素P450s的活性升高，也會(huì)降低殺蟲劑效果，從而引發(fā)棉蚜抗性的產(chǎn)生［23］。Peng等［24］檢測(cè)出棉蚜抗性品系P450s的含量比敏感品系高，說明P450s表達(dá)量的增加有助于棉蚜解毒作用的增強(qiáng)。但是無論對(duì)其活性還是含量增加的評(píng)價(jià)，均是通過害蟲體內(nèi)P450超家族中所有成員的含量或活性測(cè)定來進(jìn)行的，無法評(píng)價(jià)某個(gè)單一P450在應(yīng)對(duì)外界刺激的變化情況，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)棉蚜 His-CYP6J1 蛋白進(jìn)行純化及其多克隆抗體的制備，為后期研究棉蚜單一P450蛋白結(jié)構(gòu)、功能及其在棉蚜抗藥性形成過程的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 棉蚜采自新疆安寧渠并于室內(nèi)用棉苗長(zhǎng)期飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：25℃，相對(duì)濕度為75%，光周期（L∶D）為16 h∶8 h。昆明白小鼠購(gòu)買于新疆醫(yī)科大第一附屬醫(yī)院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 蛋白Marker購(gòu)于Thermo Scientific；Ni-NTA Agarose 購(gòu)自Qiagen公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和DAB顯色試劑購(gòu)自北京中杉金橋有限公司，其余所用的化學(xué)試劑（尿素、咪唑、無水乙醇、二甲苯等）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。加拿大Motic B5 professional series光學(xué)顯微鏡，美國(guó)紫外/可見分光光度計(jì)NanoDrop-1000。

1.2 方法

1.2.1 棉蚜 His-CYP6J1 融合蛋白的獲得及純化 將能表達(dá)出棉蚜 His-CYP6J1 融合蛋白的菌種接種到10 mL含卡納抗生素（50 mg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，37℃高速振蕩（220 r/min）培養(yǎng)過夜；按 1∶100 的體積比轉(zhuǎn)接到1 L含有卡納抗生素（50 mg/mL）LB液體培養(yǎng)基中，37℃高速振蕩（220 r/min）培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8 時(shí)，取1 mL 不加IPTG的菌液為誘前作對(duì)照，然后加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L），培養(yǎng)4 h 后取1 mL 菌液作誘后蛋白，然后低溫（4℃）離心收集菌液。先用PBS（pH7.2-7.4）緩沖液洗滌并懸浮沉淀，加入1 mmol/L 蛋白酶抑制劑PMSF，在冰上超聲破碎菌體至相對(duì)透亮（間隔5 s，共30 min），4℃，12 000 r/min 離心10 min，將上清和沉淀分開處理，分別取1 mL 上清和沉淀用15%的SDS-PAGE進(jìn)行分析，證實(shí) His-CYP6J1 融合蛋白。

收集包涵體沉淀，并用PBS（pH7.2-7.4）緩沖液洗滌包涵體沉淀，然后加入8 mL 8 mol/L 尿素變性緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L β-ME，8 mol/L 尿素，0.2% Tritonx-100，10 mmol/L咪唑）懸浮包涵體并室溫過夜。將處理得到的總蛋白按照Ni-NTA His Tag Kit說明書依次用含不同濃度咪唑（40 mmol/L，3次；80 mmol/L，3次；100 mmol/L，3次；200 mmol/L，2次）進(jìn)行洗脫，分別收集所有過程的流出液并進(jìn)行標(biāo)記。15%的SDS-PAGE檢測(cè)，與預(yù)測(cè)大小一致、條帶較粗且單一的樣品所對(duì)應(yīng)的流出液即是所需要純化的His-CYP6J1 融合蛋白。收集純化后的蛋白溶液放入透析袋，用不同濃度的透析液（4、2和0 mol/L尿素）透析，且每24 h更換透析液。

1.2.2 His-CYP6J1 融合蛋白含量的測(cè)定 以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，按Bradford［25］的方法測(cè)定 His-CYP6J1融合蛋白的含量。

1.2.3 免疫小鼠制備抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體 以純化的棉蚜His-CYP6J1融合蛋白為抗原，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫程序［26］進(jìn)行免疫。將等體積的His-CYP6J1 融合蛋白與完全弗氏佐劑充分乳化，采用背部多點(diǎn)皮下的免疫方法，以每只50 μg劑量免疫小鼠。于2周和4周后分別將棉蚜His-CYP6J1融合蛋白與不完全弗氏佐劑充分乳化，以相同的劑量和免疫途徑免疫小鼠。每次免疫后對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血法收集血清［27］。

1.2.4 ELISA檢測(cè)小鼠抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體效價(jià) 用濃度為20 μg/mL的His-CYP6J1融合蛋白包被ELISA板于4℃過夜，次日用PBST緩沖液洗滌3次，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h。再用PBST緩沖液洗滌3次后加入不同稀釋濃度的小鼠血清，37℃孵育2 h。洗滌后以1∶3 000的稀釋比例加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。PBST洗3次后加TMB底物顯色，避光顯色20 min后，加入2 mol/L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450。未免疫前的血清為對(duì)照，其A450值為N；免疫后的A450值為P，以P/N＞2.1判斷為陽性。

1.2.5 免疫組化法檢測(cè)抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體的特異性 選取棉蚜成蟲和3齡棉鈴蟲幼蟲進(jìn)行免疫組化試驗(yàn)，檢測(cè)抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體的特異性，具體方法參照文獻(xiàn)［28］。因?yàn)槊扪羵€(gè)體比棉鈴蟲個(gè)體小，因此免疫組化法有需要改進(jìn)的步驟，具體方法如下：

（1）固定：將棉蚜放入4%的多聚甲醛緩沖溶液中，在4℃中固定24 h以上。

（2）脫水：棉蚜在濃度為30%、50%、70%、80%、95%和100%的乙醇溶液脫水處理20 min。

（3）透明：將棉蚜放入等體積無水乙醇、二甲苯混合溶液中處理1 h，再在二甲苯溶液中處理2次，分別處理40 min、30 min。最后將組織于38℃溫箱中過夜。

（4）浸蠟：在56℃溫箱中，待石蠟完全溶入二甲苯后處理1 h，反復(fù)兩次，每次浸蠟1 h。

（5）包埋：將帶有棉蚜組織的蠟液倒入牛皮紙疊好的槽中，使其凝固。

（6）切片：將棉蚜按照縱切的方式及棉鈴蟲橫切的方式切成2 μm厚度的蠟片。

（7）烤片：載玻片平鋪后，室溫靜置1 h，于56℃恒溫培養(yǎng)箱中烘烤1 h。

（8）脫蠟：組織切片在二甲苯中脫蠟3次，每次20 min，再分別放入100%、90%、80%、75%的乙醇溶液中各3 min，蒸餾水洗滌3次，每次3 min。

（9）抗原修復(fù)：用檸檬酸鹽緩沖液浸沒組織切片，溫度維持在92℃ 10 min左右。待緩沖液冷卻至常溫后，用PBS（pH7.4）溶液洗滌3次，每次3 min。蒸餾水洗滌3次，每次3 min。

（10）抗原封閉：PBST配置5%的脫脂奶粉，滴加在組織上，37℃孵育3 h。

（11）一抗孵育：用0.5%脫脂奶粉以1∶100比例稀釋一抗后滴加在組織上，4℃孵育過夜，37℃孵育1 h。甩去一抗，用PBS溶液洗滌3次，每次3 min。蒸餾水洗滌3次，每次3 min。

（12）二抗孵育：用0.5%脫脂奶粉以1∶1 000稀釋二抗，滴加在組織切片上，37℃放置3 h。甩去二抗后PBS洗滌3次，每次3 min。蒸餾水洗滌3次，每次3 min。

（13）DAB顯色：將現(xiàn)配現(xiàn)用的DAB顯色劑滴加在組織上，顯色3 min，顯色結(jié)束后立馬用蒸餾水吸取DAB顯色液。

（14）拍照：使用Nikon NIS-Elements D顯微鏡進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果

2.1 His-CYP6J1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

15%的SDS-PAGE檢測(cè)大量誘導(dǎo)的His-CYP6J1融合蛋白（圖1），與誘導(dǎo)表達(dá)前相比，重組質(zhì)粒pET28a-CYP6J1的菌種經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后和沉淀中有一條蛋白質(zhì)增強(qiáng)條帶，分子量約為57 kD，與預(yù)期的His-CYP6J1融合蛋白相對(duì)分子量相似，結(jié)果初步說明His-CYP6J1融合蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)成功，可進(jìn)行His-CYP6J1 融合蛋白的純化工作。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)His-CYP6J1融合蛋白的表達(dá)

2.2 His-CYP6J1融合蛋白純化

因?yàn)镠is-CYP6J1融合蛋白的N端帶有His標(biāo)簽，所以采用Ni-NTA-agarose親和層析柱進(jìn)行純化。15%的SDS-PAGE檢測(cè)顯示（圖2），用80 mmol/L和100 mmol/L咪唑洗脫的目的蛋白條帶單一、清晰而且相對(duì)表達(dá)量較大，純化后的蛋白與目的蛋白大小一致。利用Bradford法蛋白濃度定量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算后，His-CYP6J1 融合蛋白含量為0.8 mg/mL，說明His-CYP6J1 融合蛋白可滿足小鼠免疫實(shí)驗(yàn)需要。

圖2 His-CYP6J1融合蛋白的純化

2.3 ELISA檢測(cè)小鼠抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體效價(jià)

His-CYP6J1融合蛋白免疫小鼠3次后，ELISA檢測(cè)小鼠的血清效價(jià)（圖3）。小鼠抗血清ELISA檢測(cè)的A450值與陰性對(duì)照相比大于2.1，3次His-CYP6J1 融合蛋白免疫小鼠后的血清效價(jià)達(dá)到1∶200 000，小鼠的抗體效價(jià)達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)，可進(jìn)行免疫組化鑒定其特異性。

圖3 ELISA檢測(cè)His-CYP6J1蛋白免疫小鼠后的血清效價(jià)

2.4 免疫組化分析

取棉蚜成蟲和3齡棉鈴蟲幼蟲為實(shí)驗(yàn)材料，經(jīng)過以小鼠抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體為一抗和以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體的免疫組化鑒定。結(jié)果表明，所制備抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體具有高特異性，用此抗體對(duì)棉蚜和棉鈴蟲組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析。在顯微鏡下可以看到（圖4），B（棉鈴蟲切片）和 D（棉蚜切片）經(jīng)一抗孵育，A（棉鈴蟲切片）和 C（棉蚜切片）未加一抗孵育，最后DAB顯色，A、B 和 C 未發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合，而相比對(duì)照組D可以看到棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗血清和棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白發(fā)生了特異性結(jié)合，結(jié)合部位是腹管和脂肪體（圖4-D）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)大量誘導(dǎo)了 His-CYP6J1 融合蛋白，誘導(dǎo)條件的不同對(duì)重組蛋白的表達(dá)量存在一定的影響，研究表明高濃度 IPTG 對(duì)蛋白表達(dá)量有抑制作用［29］，而低濃度的 IPTG 會(huì)減少對(duì)細(xì)胞的損傷［30］，所以，經(jīng)摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件，本實(shí)驗(yàn)將 IPTG 濃度確定為 0.5 mmol/L，結(jié)果表明，該濃度大量誘導(dǎo) His-CYP6J1 融合蛋白是適合的。

實(shí)驗(yàn)通過親和層析法成功分離純化了 His-CYP6J1 融合蛋白，并以它為抗原制備了其相應(yīng)的抗棉蚜P450 CYP6J1多克隆抗體，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)約1∶200 000。細(xì)菌表達(dá)的融合蛋白可用于多方面的研究，如蛋白間的相互作用分析，蛋白激酶活性的研究，作為抗原用于多克隆抗體的制備及其它結(jié)構(gòu)或功能的研究。蛋白是基因功能的主要表現(xiàn)形式，高效價(jià)的抗體是基因功能研究的一種重要工具，因此高效價(jià)抗體是抗原檢測(cè)的關(guān)鍵［31］。本實(shí)驗(yàn)在制備抗血清的過程中，純化棉蚜 His-CYP6J1 融合蛋白是最關(guān)鍵的步驟。pH、溫度、時(shí)間都會(huì)影響蛋白的純化效率，從圖2中可以看出泳道1的流出液和泳道2的洗雜液中包含一定量的 His-CYP6J1 融合蛋白，可能的原因是誘導(dǎo)后的蛋白在與柱結(jié)合時(shí)已達(dá)到層析柱結(jié)合的飽和度或者與之結(jié)合的時(shí)間不夠長(zhǎng)，因此我們需要不斷地優(yōu)化純化條件，從而獲得量大又單一的目的蛋白。

圖4 免疫組化鑒定多克隆抗體的特異性

由于棉蚜個(gè)體比棉鈴蟲個(gè)體小，因此免疫組化實(shí)驗(yàn)的脫水和脫蠟過程需要相應(yīng)的縮短時(shí)間，縮短時(shí)間到 20 min［28］，以免切片后呈現(xiàn)不出完整的組織結(jié)構(gòu)。免疫組化結(jié)果與對(duì)照組相比所制備的抗血清能夠與棉蚜P450 CYP6J1天然蛋白特異性結(jié)合，結(jié)合部位發(fā)生在棉蚜的脂肪體，這與細(xì)胞色素P450酶系在棉鈴蟲中腸、脂肪體等器官中的的表達(dá)量較高相一致［5］。棉蚜的腹管中該蛋白的表達(dá)量也相對(duì)較高，這與棉蚜腹管的功能密切相關(guān)。棉蚜腹管具有分泌蜜露以及飼育幼蚜、排出代謝產(chǎn)物以及排蠟抵御天敵等功能［32］，這些可能均需要P450s在棉蚜生命周期及繁殖力等方面發(fā)揮重要作用。但在棉鈴蟲沒有發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合反應(yīng)，說明作為棉花的兩種重要害蟲，雖然棉蚜P450 CYP6J1蛋白與棉鈴蟲的P450 CYP6B6蛋白均屬于6家族，但兩者基因序列的ORF相似性僅為43.05%。

4 結(jié)論

本研究在大腸桿菌中進(jìn)行大量表達(dá)和純化獲得條帶單一的His-CYP6J1融合蛋白，并利用純化的融合蛋白免疫小鼠獲得針對(duì)棉蚜P450 CYP6J1 特異性較高的多克隆抗體。

［1］Fire A, Xu SQ, Montgomeyr MK, et al. Potent and specific genetic interference by double-strnaded RNA in Caenorhabditis elegans［J］. Nature, 1998, 391：806-811.

［2］Kennerdell JR, Carthew RW. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway［J］. Cell, 1998, 95（7）：1017-1026.

［3］Timmons L, Fire A. Specific interference by ingested dsRNA［J］. Nature, 1998, 395（6705）：854.

［4］Stegeman JJ, Livingstone DR. Forms and functions of cytochrome P450［J］. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Pharmacology Toxicology & Endocrinology, 1998, 121（1-3）：1-3.

［5］Brun A, Cuany A, Le Mouel TL, et al. Inducibility of the Drosophila melanogaster, cytochrome P450 gene, CYP6A2, by phenobarbital in insecticide susceptible or resistant strains［J］. Insect Biochemistry & Molecular Biology, 1996, 26（7）：697-703.

［6］唐濤, 劉雪源, 邱立紅, 等. RNA干擾及其對(duì)昆蟲抗藥性相關(guān)基因的沉默研究［J］. 棉花學(xué)報(bào), 2010, 22（6）：617-624.

［7］Bernhardt R. RNA interference and its application on silencing of insecticide-resistant genes in insects［J］. Journal of Biotechnology, 2006, 124（1）：128-45.

［8］Blackman RL, Eastop VF. Aphids on the world’s crops trees：an identification and information guide［J］. Oriental Insects, 2000, 35（1）：400-400.

［9］Thorpe P, Cock PJA, Bos J. Comparative transcriptomics andproteomics of three different aphid species identifies core and diverse effector sets［J］. BMC Genomics, 2016, 17（1）：1-18.

［10］王蔭長(zhǎng), 韓召軍. 我國(guó)農(nóng)業(yè)害蟲抗藥性發(fā)生概況［J］. 應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào), 1991（2）：120-121.

［11］Ahuja I, Rohloff J, Bones AM. Defence mechanisms of Brassicaceae：implications for plant-insect interactions and potential for integrated pest management. A review［J］. Agronomy for Sustainable Development, 2010, 30（2）：311-348.

［12］龔坤元, 張桂林, 翟桂榮. 棉蚜對(duì)“1059”抗藥性的測(cè)定［J］.昆蟲學(xué)報(bào), 1964, 13（1）：1-9.

［13］Liu N, Zhu F, Xu Q, et al. Behavioral change, physiological modification, and metabolic detoxification：mechanisms of insecticide resistance［J］. Acta Entomologica Sinica, 2006, 49：671-679.

［14］Delorme R, Augé D, Béthenod MT, et al. Insecticide resistance in a strain of Aphis gossypii from Southern France［J］. Pesticide Science, 1997, 49（1）：90-96.

［15］Silver ARJ, Emden HFV, Battersby M. A biochemical mechanism of resistance to pirimicarb in two glasshouse clones of Aphis gossypii［J］. Pest Management Science, 1995, 43（1）：21-29.

［16］Moores GD, Gao X, Denholm I, et al. Characterisation of insensitive acetylcholinesterase in insecticide-resistant Cotton Aphids, Aphis gossypii glover（Homoptera：Aphididae）［J］. Pesticide Biochemistry & Physiology, 1996, 56（2）：102-110.

［17］Gong YH, Yu XR, Shang QL, et al. Oral delivery mediated RNA interference of a carboxylesterase gene results in reduced resistance to organophosphorus insecticides in the cotton Aphid, Aphis gossypii Glover［J］. PLoS One, 2014, 9（8）：e102823.

［18］呂敏, 孫婳婳, 王麗紅, 等. 植物次生物質(zhì)對(duì)棉蚜谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶活性的誘導(dǎo)作用［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28（3）：253-256.

［19］Scott JG. Cytochromes P450 and insecticide resistance［J］. Insect Biochemistry & Molecular Biology, 1999, 29（9）：757-777.

［20］Vontas J, Blass C, Koutsos AC, et al. Gene expression in insecticide resistant and susceptible Anopheles gambiae strains constitutively or after insecticide exposure［J］. Insect Molecular Biology, 2005, 14（5）：509-521.

［21］Puinean AM, Foster SP, Oliphant L, et al. Amplification of a cytochrome P450 gene is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae［J］. PLoS Genetics, 2010, 6（6）：e1000999.

［22］Kalajdzic P, Markaki M, Oehler S, et al. Imidacloprid does not induce cyp genes involved in insecticide resistance of a mutant Drosophila melanogaster line［J］. Food & Chemical Toxicology, 2013, 60（10）：355-359.

［23］郭天鳳, 史雪巖, 高希武, 等. 棉蚜吡蟲啉、啶蟲脒不同品系解毒酶活性測(cè)定和增效劑作用的研究［J］. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào), 2014, 36（3）：388-394.

［24］Peng T, Pan Y, Yang C, et al. Over-expression of CYP6A2, is associated with spirotetramat resistance and cross-resistance in the resistant strain of Aphis gossypii, Glover［J］. Pesticide Biochemistry & Physiology, 2015, 126：64-69.

［25］Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding［J］. Analytical Biochemistry, 2015, 72（1-2）：248-254.

［26］GRTB. Immunology—A short course（2nd edition）：Editors. E Benjamini and S Leskowitz［M］. New York：Wiley-Liss, 1991：459pp.

［27］黃麗娜, 程婷婷, 王新繪, 等. 棉鈴蟲β-actin基因的克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31（12）：138-145.

［28］魏原杰, 張雷, 程婷婷, 等. 棉鈴蟲細(xì)胞色素P450 CYP6B6多克隆抗體的制備［J］. 生命科學(xué)研究, 2015（6）：497-500.

［29］Chang GD, Li ZL, Qin JY, et al. Optimization of fermentation of recombinant human Endostatin（rh-Endostatin）expression in Escherichia coli［J］. Chinese Journal of Biotechnology, 2005, 21（4）：662-666.

［30］李東江, 鄭穎, 葉鋒平, 等. 蛇毒類凝血酶基因大腸桿菌和酵母細(xì)胞表達(dá)條件的優(yōu)化［J］. 西南國(guó)防醫(yī)藥, 2010, 20（6）：670-672.

［31］于殿宇, 羅淑年, 王瑾, 等. 海藻酸鈉-明膠固定化磷脂酶的研究［J］. 食品工業(yè), 2008（3）：9-11.

［32］ 劉玉素. 棉蚜腹管的組織構(gòu)造和幾個(gè)關(guān)于腹管功能的試驗(yàn)［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào), 1956, 8（1）：17-28.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation and Purification of His-CYP6J1 Fusion Protein from Aphis gossypii and Preparation of Its Polyclonal Antibody

WANG Ya-mei WEI Yuan-jie AI Xin-yu LIU Xiao-ning
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumuqi 830046）

This work aims to purify His-CYP6J1 fusion protein through affinity chromatography，and prepare and identify its polyclonal antibody. The fusion protein was purified by Ni-NTA chelating column，the purified product was detected by SDS-PAGE. Then the acquired fusion protein His-CYP6J1 was used to immune mice for preparing its polyclonal antibody against Aphis gossypii. Finally，ELISA was used to test antibody’s titer，and immunohistochemistry to identify its specificity. As results，antiserum titer was 1：200 000，the polyclonal antibody specifically bound to natural P450 CYP6J1 protein from A. gossypii，but not to the one from cotton bollworm. These results provide a foundation for studying the structure and function of a single P450 protein and its role in the insecticide- resistance of A. gossypii.

P450 CYP6J1 fusion protein；protein purification；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0920

2016-10-09

自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（qn2015yx001），NSFC-新疆聯(lián)合項(xiàng)目（U1603331）

王亞美，女，碩士研究生，研究方向：生化與分子生物學(xué)；E-mail：wangyamei0114@sina.com

劉小寧，女，博士，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治；E-mail：liuxn0103@sina.com