劉帥軍 沈丹 鐘繼漢 陳偉 王偉 張麗 陳才 楊昆侖 高波 宋成義

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的斑馬魚(yú)增強(qiáng)子捕獲注解分析

劉帥軍 沈丹 鐘繼漢 陳偉 王偉 張麗 陳才 楊昆侖 高波 宋成義

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009）

為了建立斑馬魚(yú)增強(qiáng)子捕獲突變體庫(kù)及研究功能基因的表達(dá)調(diào)控模式，制備了SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)（F0），通過(guò)繁育建立了組織或器官特異表達(dá)報(bào)告基因綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的品系（F1）。選擇F1代的SK-3系（腦部特異表達(dá)GFP）與野生型TU系斑馬魚(yú)交配，收集受精卵（F2），于24 hpf（Hour post fertilization）、2 dpf（Day post fertilization）、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf 6個(gè)發(fā)育階段檢測(cè)報(bào)告基因綠色熒光蛋白的表達(dá)模式；然后通過(guò)Splinkerette PCR（SP-PCR）方法檢測(cè)SB轉(zhuǎn)座子在斑馬魚(yú)基因組中的插入位置，從而確定捕獲的增強(qiáng)子和功能基因；最后通過(guò)胚胎原位雜交驗(yàn)證內(nèi)源基因表達(dá)模式。結(jié)果表明，在F2代胚胎不同發(fā)育階段，GFP表達(dá)具有明顯的時(shí)空特性，前期在前腦，中腦，后腦三個(gè)部位均高水平表達(dá)，后期表達(dá)部位呈后移趨勢(shì)，各個(gè)發(fā)育期表達(dá)強(qiáng)度基本無(wú)變化，結(jié)果提示該捕獲增強(qiáng)子具有腦部表達(dá)特性。sp-PCR結(jié)果分析表明增強(qiáng)子位于基因組1號(hào)染色體 35、914、498-35、914、621位置，在內(nèi)源性基因ednraa位點(diǎn)附近。原位雜交結(jié)果表明該基因在胚胎24 hpf階段具有轉(zhuǎn)錄活性。本研究結(jié)果提示SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)可高效獲得插入突變斑馬魚(yú)，對(duì)研究基因功能和獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新基因具有重要作用。

增強(qiáng)子捕獲；注解；SB；斑馬魚(yú)

增強(qiáng)子在真核生物的基因調(diào)控中，是一個(gè)重要的順式元件，起到調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的開(kāi)關(guān)作用［1］，能對(duì)靶向基因進(jìn)行時(shí)空表達(dá)的調(diào)控［2］。增強(qiáng)子的活性則受到多種因素的影響，只有在特定條件下才能增加靶向基因的表達(dá)，因此增強(qiáng)子的活性是處在不斷變化之中［2］。增強(qiáng)子的獲得對(duì)研究基因表達(dá)調(diào)控特性具有重要意義，但用傳統(tǒng)的方法去獲得和注解增強(qiáng)子是相當(dāng)困難的。增強(qiáng)子捕獲（Enhancer trapping，ET）是用來(lái)確定一段DNA序列中是否包含增強(qiáng)子功能的一項(xiàng)技術(shù)，是一種研究增強(qiáng)子控制細(xì)胞中基因時(shí)空表達(dá)模式特征的有效方法［3］。增強(qiáng)子捕獲載體通常由迷你啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因隨機(jī)整合到基因組中用以提供一種直接簡(jiǎn)單的手段來(lái)測(cè)定控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)模塊［4］。最早在1992年，Korn等［5］已嘗試在小鼠上建立增強(qiáng)子檢測(cè)方法，隨后Grabher等［6］在青鳉（Medaka）中成功應(yīng)用了以轉(zhuǎn)座子為介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)，在斑馬魚(yú)上也有SB轉(zhuǎn)座子［7］，TOL2轉(zhuǎn)座子［8］介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲的報(bào)道。

斑馬魚(yú)屬脊椎動(dòng)物亞門(mén)，輻鰭魚(yú)綱（Actinopterygii），鯉科，短擔(dān)尼魚(yú)屬（Danio）的一種硬骨魚(yú)，因其全身分布有深藍(lán)色與銀白色相間的縱紋，酷似非洲草原斑馬而得名斑馬魚(yú)。至20世紀(jì)80年代斑馬魚(yú)被引入實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)如今已成為研究脊椎動(dòng)物發(fā)育學(xué)和胚胎學(xué)的模式生物［9，10］。斑馬魚(yú)基因序列與人類(lèi)基因的高度同源性，達(dá)到了87%的相似性，近年來(lái)被用于作為研究人類(lèi)各種疾病的模型，廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域［11］。斑馬魚(yú)的受精卵容易大量獲得、發(fā)育快、胚胎透明，在受精24 h后已經(jīng)有器官的發(fā)生，發(fā)育至5 d時(shí)主要的器官已經(jīng)形成并發(fā)揮相應(yīng)的作用，這些特點(diǎn)便于對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行遺傳學(xué)操作及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)育過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚(yú)為模式生物，初步探討SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)的有效性，從而為高通量捕獲增強(qiáng)子和基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Tuebingen斑馬魚(yú)（Danio rerio）購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心；SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)F1 代SK-3系為本實(shí)驗(yàn)室制備。

基因組提取試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司，限制性?xún)?nèi)切酶Sau3A1，T4 DNA Ligase，Annealing Buffer均購(gòu)自NEB有限公司，無(wú)RNA酶DNAse1，RNAsein，NaOH，鏈酶蛋白酶，多聚甲醛，PTU，HEPES，Tween20，tRNA，肝素鈉，苯酚，氯仿，HCl，BCIP，NBT等購(gòu)自Sigma公司；地高辛標(biāo)記RNA混合液，蛋白酶K，羊抗地高辛標(biāo)記物抗體等購(gòu)自Roche公司；轉(zhuǎn)錄緩沖液，T7 RNA聚合酶等購(gòu)自Promega公司；去離子甲酰胺購(gòu)自CarloErba；羊血清，無(wú)水甲醇，NaCl，KCl，MgCl2，無(wú)水乙醇等購(gòu)自國(guó)藥。

1.2 方法

1.2.1 F2代魚(yú)胚收集和熒光檢測(cè) 將SK-3系與TU系野生型斑馬魚(yú)進(jìn)行交配，獲得F2代胚胎，培養(yǎng)于E3溶液中至特定的發(fā)育時(shí)期以備熒光檢測(cè)。在體式熒光顯微鏡（M165FC，Lecia，德國(guó)）下觀察不同時(shí)期的胚胎GFP的表達(dá)并做好記錄。本實(shí)驗(yàn)中觀察的胚胎GFP的表達(dá)時(shí)期分別是24 hpf、2 d、3 d、4 d、5 d、7 d。在檢測(cè)完熒光之后，收集5-10尾F2代斑馬魚(yú)繼續(xù)飼養(yǎng)至20 d后提取基因組備用。

1.2.2 Splinkerette PCR

1.2.2.1 PCR引物序列 根據(jù)轉(zhuǎn)座元件序列設(shè)計(jì)兩輪PCR引物，接頭序列參考文獻(xiàn)［12］，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Splinkerette PCR兩輪PCR引物序列

1.2.2.2 基因組提取 本實(shí)驗(yàn)采用TaKaRa的基因組提取試劑盒提取飼養(yǎng)20 d的F2代斑馬魚(yú)的基因組，將獲得的DNA經(jīng)Nanodrop核酸測(cè)定儀（Nanodrop1000，美國(guó)）測(cè) 得 濃 度 為380 ng/μL，OD260/OD280=1.85，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 基因組打斷 50 μL反應(yīng)體系為：Genomic DNA 5 μL，10×NEB BUFFER 5 μL，Sau3A1 3 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。將反應(yīng)體系置于37℃過(guò)夜處理，之后用TaKaRa的DNA片段純化試劑盒進(jìn)行純化并用45 μL ddH2O洗脫。

1.2.2.4 接頭合成 合成體系為50 μL：SPLNK-BOT 2 μL，SPLNKGATC-TOP 2 μL，Annealing Buffer 46 μL。反應(yīng)程序：95℃，3 mins；自然降至室溫，約30 mins，-20℃保存。

1.2.2.5 接頭連接（Ligated genomic DNA） 50 μL體系包括：Digested genomic DNA 37 μL，10X T4Ligase Buffer 5 μL，annealed splinkerette oligonucleotide 6 μL，T4 DNA Ligase（400 U/μl）1.5 μL，連接反應(yīng)條件：16℃，16 h。

1.2.2.6 PCR擴(kuò)增 第一輪PCR（Round 1 PCR）體系50 μL為L(zhǎng)igated genomic DNA 10 μL，ddH2O 11 μL，2× Taqmix 25 μL，F(xiàn)12 2 μL，SB1N 2 μL，PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性 4 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循 環(huán)；最后72℃延伸10 min。第2輪PCR（Round 2 PCR） 體 系50 μL為Round 1 PCR product 1 μL，ddH2O 20 μL，2x Taqmix 25 μL，F(xiàn)14 2 μL，SB2N 2 μL，PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循 環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳并切膠回收，測(cè)序。

1.2.3 增強(qiáng)子注解 將測(cè)序獲得的染色體側(cè)翼DNA序列通過(guò)BLASTN與ENSEMBL的斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GRCz10）進(jìn)行比對(duì)。從Ensembel瀏覽器上下載斑馬魚(yú)（Zebrafish）、青鳉（Medaka）、東方紅鰭鲀（Fugu）的側(cè)翼序列上下游各50KB區(qū)域的基因組序列（www.ensembl.org），并將所得到的序列進(jìn)行比對(duì)分析（http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit. shtml）。

1.2.4 原位雜交 根據(jù)插入位點(diǎn)處的內(nèi)源基因Ednraa編碼序列設(shè)計(jì)RNA原位雜交探針。采用地高辛和T7RNA聚合酶標(biāo)記合成反義RNA探針。參考文獻(xiàn)［13］進(jìn)行斑馬魚(yú)胚胎原位雜交，通過(guò)熒光體式顯微鏡（M165FC，Lecia，德國(guó)）采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 F2代胚胎不同發(fā)育時(shí)期GFP表達(dá)

將 SK-3系F1與TU系斑馬魚(yú)進(jìn)行雜交，收集胚胎于E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行觀察，結(jié)果（圖1）表明從24 hpf開(kāi)始，在熒光顯微鏡下可觀察到斑馬魚(yú)胚胎腦部有明顯的熒光表達(dá)，熒光位置分別是前腦、中腦和后腦。在 2 dpf、3 dpf、4 dpf、5 dpf、7 dpf等發(fā)育時(shí)期熒光仍集中于腦部，表達(dá)強(qiáng)度基本無(wú)變化，而表達(dá)部位有所改變（圖2），體現(xiàn)出基因表達(dá)調(diào)控的時(shí)空特性。

圖1 SK-3斑馬魚(yú)胚胎24 hpf的腦部熒光表達(dá)情況

2.2 增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的增強(qiáng)子注解分析

將測(cè)序結(jié)果中得到的染色體側(cè)翼DNA序列在ENSEMBL的斑馬魚(yú)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（GRCz10）中進(jìn)行比對(duì)，表明捕獲載體插入1號(hào)染色體，捕獲的增強(qiáng)子位于內(nèi)源基因ednraa 上游20 kb 處。再?gòu)腅nsembel瀏覽器上下載注解所需的序列文件，經(jīng)分析獲得增強(qiáng)子注解圖（圖3）。

2.3 原位雜交

針對(duì)注解得到的結(jié)果，根據(jù)Ednraa基因編碼序列設(shè)計(jì)其反義RNA探針，進(jìn)行原位雜交驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。陰性對(duì)照組胚胎的熒光集中于頭部，而Ednraa 反義RNA探針的原位雜交結(jié)果顯示胚胎整體明顯著色，且頭部著色較深。

3 討論

近年來(lái)，利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)法進(jìn)行斑馬魚(yú)基因捕獲、增強(qiáng)子捕獲，獲得突變體，進(jìn)而研究基因功能及表達(dá)調(diào)控已獲得較大進(jìn)展。研究表明來(lái)自Tc1/源性基因kctd15a與轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)熒光蛋白表達(dá)模式密切相近，在隨后的發(fā)育階段在神經(jīng)組織中也有相似的時(shí)空表達(dá)特征。Asakawa等［22］和Takeuchi等［23］Mariner 超家族的SB轉(zhuǎn)座子［14］，可在不同物種中具有轉(zhuǎn)座活性，已廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、哺乳動(dòng)物等的轉(zhuǎn)基因研究［15-19］。由于轉(zhuǎn)座子在宿主基因組的高效插入，在斑馬魚(yú)上利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)增強(qiáng)子捕獲技術(shù)鑒定了大量增強(qiáng)子［20］。Parinov 等［8］利用TOL2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)斑馬魚(yú)增強(qiáng)子捕獲，建立突變品系，研究斑馬魚(yú)發(fā)育的相關(guān)功能基因。Balciunas等［7］利用SB轉(zhuǎn)座子，在斑馬魚(yú)中進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲研究，建立了9個(gè)突變品系。本課題組采用SB介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)獲得了大量斑馬魚(yú)插入突變體，通過(guò)報(bào)告基因GFP可確定捕獲的增強(qiáng)子和內(nèi)源基因時(shí)空表達(dá)特性，大大提高了篩選效率。我們已通過(guò)表型篩選建立了若干個(gè)突變品系，本研究所用品系表型為頭部區(qū)域發(fā)綠色熒光，對(duì)該品系進(jìn)行注解，獲得了腦部發(fā)育調(diào)控增強(qiáng)子，并在其下游定位了一個(gè)內(nèi)源基因。利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)在斑馬魚(yú)上進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲研究是目前最有效的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)，篩選突變表型斑馬魚(yú)系，為研究相關(guān)基因的調(diào)控模式提供了很好的工具。Naouel等［21］通過(guò)增強(qiáng)子捕獲技術(shù)捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系（ub49），發(fā)現(xiàn)載體插入位點(diǎn)附近內(nèi)先后分別利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo) Gal4-UAS 系統(tǒng)在斑馬魚(yú)上進(jìn)行腦部神經(jīng)組織電路分析和增強(qiáng)子捕獲研究。本研究建立的斑馬魚(yú)品系SK-3，其插入位點(diǎn)附件存在內(nèi)源基因Ednraa，對(duì)該基因進(jìn)行RNA原位雜交，結(jié)果表明該基因具有明顯的轉(zhuǎn)錄活性，且在頭部表達(dá)水平較高，提示該基因在腦部的表達(dá)可能被位于其上游的增強(qiáng)子調(diào)控，而該增強(qiáng)子具有腦部表達(dá)特異性。因此，本研究捕獲得增強(qiáng)子可能與腦部早期發(fā)育有關(guān)，該增強(qiáng)子的表達(dá)特性和內(nèi)源基因的確切功能尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 SK-3增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)不同發(fā)育時(shí)期的熒光表達(dá)情況

圖3 SK-3增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的增強(qiáng)子注解

圖4 sk-3系F2代胚胎24 hpf原位雜交圖

相比用F1代轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)進(jìn)行注解，本實(shí)驗(yàn)直接利用增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú) F2代對(duì)其進(jìn)行注解，F(xiàn)2代的GFP表達(dá)的表型更穩(wěn)定，在采集熒光圖片以及后續(xù)的基因組注解上可以耗費(fèi)更少的時(shí)間和精力，大大提高了研究效率。本研究獲得了腦部特異表達(dá)GFP的增強(qiáng)子捕獲系，通過(guò)其不同發(fā)育階段的表達(dá)模式，可以揭示增強(qiáng)子的調(diào)控模式及對(duì)早期胚胎組織器官發(fā)育相關(guān)的功能基因。本研究與報(bào)道的增強(qiáng)子捕獲系不同［7］，從而豐富了增強(qiáng)子研究素材。本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)SK-3系轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)進(jìn)行了較為詳細(xì)的注解，獲得了斑馬魚(yú)早期胚胎腦部發(fā)育相關(guān)的增強(qiáng)子可能的位置及其調(diào)控的內(nèi)源性基因Ednraa，該基因與人類(lèi)基因組中EDNRA蛋白有高達(dá)73%的同源性，而Gordon等［24］研究發(fā)現(xiàn)EDNRA的突變會(huì)導(dǎo)致伴有禿頭癥的頜面脂肪癥，而本研究注釋得到的斑馬魚(yú)的內(nèi)源基因Ednraa，因其高度的同源性使得斑馬魚(yú)更好地作為研究人類(lèi)疾病的模式動(dòng)物。由于GFP表達(dá)模式可直接表明該基因時(shí)空表達(dá)特性，RNA原位雜交初步結(jié)果也說(shuō)明GFP與Ednraa的表達(dá)模式基本一致，進(jìn)一步說(shuō)明該基因可能受到所捕獲的增強(qiáng)子元件的調(diào)控，提示基因捕獲技術(shù)對(duì)研究基因功能高度有效。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)SB介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)獲得了腦部穩(wěn)定表達(dá)GFP的斑馬魚(yú)增強(qiáng)子捕獲品系SK-3；通過(guò)生物信息學(xué)注解獲得了所捕獲的增強(qiáng)子的染色體位置及其下游調(diào)控的內(nèi)源基因Ednraa；GFP與Ednraa的表達(dá)模式具有一致性。SK-3系可為斑馬魚(yú)腦部神經(jīng)發(fā)育情況的研究提供良好的動(dòng)物模型。

［1］賈春平, 曾溢滔. 增強(qiáng)子作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 生命科學(xué), 2002, 14（2）；73-76.

［2］孫長(zhǎng)斌, 張曦. 超級(jí)增強(qiáng)子研究進(jìn)展［J］. 遺傳, 2016, 38（12）：1056-1068.

［3］CY Liu, Song GL, Mao L, et al. Generation of an enhancer-trapping vector for insertional mutagenesis in zebrafish［J］. PLoS One, 2015, 10（10）：1-21.

［4］Bellen HJ. Ten years of enhancer detection：lessons from the fly［J］. Plant Cell, 1999, 11（12）：2271-2281.

［5］Korn R, Schoor M, Neuhaus H, et al. Enhancer trap integrations in mouse embryonic stem cells give rise to staining patterns in chimaeric embryos with a high frequency and detect endogenous genes［J］. Mechanisms of Development, 1992, 39（1-2）：95-109.

［6］Grabher C, Henrich T, Sasado T, et al. Transposon-mediated enhancer trapping in medaka［J］. Gene, 2003, 322：57-66.

［7］Balciunas D, Davidson AE, Sivasubbu S, et al. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon［J］. BMC Genomics, 2004, 5, （1）：62.

［8］Parinov S, Kondrichin I, Korzh V. et al. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo［J］. Developmental Dynamics, 2004, 231（2）：449-59.

［9］Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish［J］. Dev Dyn, 1995, 203（3）：253-310.

［10］Grunwald DJ, Eisen JS. Headwaters of the zebrafish -emergence of a new model vertebrate［J］. Nat Rev Genet, 2002, 3（9）：717-724.

［11］ 李禮, 羅凌飛. 以斑馬魚(yú)為模式動(dòng)物研究器官的發(fā)育與再生［J］. 遺傳, 2013, 35（4）：421-432.

［12］Potter CJ, Luo L. Splinkerette PCR for mapping transposable elements in Drosophila［J］. PLoS One, 2010, 5（4）：e10168.

［13］Thisse C, Thisse B. High-resolution in situ hybridization to wholemount zebrafish embryos［J］. Nat Protoc, 2008, 3（1）：59 - 69.

［14］Ivics Z, Hackett PB, Plasterk RH, et al. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells［J］. Cell, 1997, 91（4）：501-510.

［15］Ivics Z, Garrels W, Mátés L, et al. Germline transgenesis in pigs by cytoplasmic microinjection of Sleeping Beauty transposons［J］. Nat Protoc, 2014, 9（4）：810-827.

［16］Tschida BR, Largaespada DA, Keng VW. Mouse models of cancer：Sleeping Beauty transposons for insertional mutagenesis screens and reverse genetic studies［J］. Semin Cell Dev Biol, 2014, 27：86-95.

［17］Mátés L. Rodent transgenesis mediated by a novel hyperactive Sleeping Beauty transposon system［J］. Methods Mol Biol, 2011, 738（2）：87-99.

［18］Carlson DF, Garbe JR, Tan WF, et al. Strategies for selection marker-free swine transgenesis using the Sleeping Beauty transposon system［J］. Transgenic Res, 2011, 20（5）：1125-1137.

［19］Izsvák Z, Chuah MK, VandenDriessche T, et al. Efficient stable gene transfer into human cells by the Sleeping Beauty transposon vectors［J］. Methods, 2009, 49（3）：287-297.

［20］沈丹, 陳才, 王賽賽, 等. Tc1/Mariner 轉(zhuǎn)座子超家族的研究進(jìn)展［J］. 遺傳, 2017, 39（1）：1-13.

［21］Naouel G, Zhao XF, Staale E, et al. Zebrafish enhancer trap line showing maternal and neural expression of kctd15a［J］. Dev Growth Differ, 2012, 54（2）：241-252.

［22］Asakawa K, Suster ML, Mizusawa K, et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105（4）：1255-1260.

［23］Takeuchi M, Matsuda K, Yamaguchi S, et al. Establishment of Gal4 transgenic zebrafish lines for analysis of development of cerebellar neural circuitry［J］. Dev Biol, 2015, 397（1）：1-17.

［24］Gordon CT, Weaver KN, Zechi-Ceide RM, et al. Mutations in the endothelin receptor type A cause mandibulofacial dysostosis with alopecia［J］. The American Journal of Human Genetics, 2015, 96（4）：519-531.

（責(zé)任編輯 李楠）

The Annotation of Enhancer-trapping Mediated by the SB Transposon in Zebrafish

LIU Shuai-jun SHEN Dan ZHONG Ji-han CHEN Wei WANG Wei ZHANG Li CHEN Cai YANG Kun-lun GAO Bo SONG Cheng-yi
（Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-product Safety，College of Animal Science & Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009）

In order to establish zebrafish enhancer-trapping mutant library and study the expression and regulation of functional genes，we prepared SB（Sleeping Beauty）transposon-mediated enhancer-trapping zebrafish F0，and built the line F1 with tissue- or organ-specific GFP（Green Fluorescent Protein）expression patterns through breeding. We selected SK-3 line of F1（head-specific expressing GFP）to breed with wild type TU zebrafish，and collected fertilized eggs. The GFP expression patterns of early embryos at 24 hpf（Hour post fertilization），2 dpf（Day post fertilization），3 dpf，4 dpf，5 dpf and 7 dpf were analyzed. SP-PCR（Splinkerette PCR）was used to detect the inserted position of SB transposon in the zebrafish genome to determine the captured enhancer and functional gene. The expression patterns of the functional gene were verified by in situ hybridization. The results showed that the expression of GFP had obvious temporal and spatial characteristics in SK-3 embryos at different developmental stages and highly expressed in the forebrain，midbrain and hindbrain at earlier stages，and was in a trend of backward at later stages. There was no variation in the expression level of each developmental stage，indicating that the captured enhancer was specifically expressed in the brain. SP-PCR results showed that the enhancer was located in the chromosome 1：35，914，498-35，914，and 621 near the ednraa. The results of in situ hybridization showed that the gene had transcription activity at the 24 hpf. Above data suggested that the SB transposon-mediated enhancer-trapping technique can be efficiently used to acquire the inserted mutant zebrafish，which has a great significance on the study of gene function and the acquisition of new genes with independent intellectual property rights.

enhancer-trapping；annotation；SB transposon；zebrafish

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0035

2017-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31671313，31572364），揚(yáng)州現(xiàn)代農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（YZ2016040）

劉帥軍，男，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)座子基因資源挖掘及其應(yīng)用；E-mail：971096931@qq.com

宋成義，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物基因組轉(zhuǎn)座子基因資源挖掘及其應(yīng)用；E-mail：cysong@yzu.edu.cn