劉鐵鐫，常 江，衛(wèi) 哲

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(哈爾濱 150001)， 2.哈爾濱市道里區(qū)群力家園社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(哈爾濱 150001)，3.浙江麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院(麗水323000)

·基礎(chǔ)研究·

電針對嗎啡戒斷大鼠不同腦區(qū)FosB基因表達的影響*

劉鐵鐫1，常 江2，衛(wèi) 哲3△

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(哈爾濱 150001)， 2.哈爾濱市道里區(qū)群力家園社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心(哈爾濱 150001)，3.浙江麗水學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院(麗水323000)

目的：觀察電針對嗎啡戒斷大鼠戒斷癥狀及不同腦區(qū)內(nèi)FosB基因表達的影響。方法：采用逐日增量背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，末次注射后3 h給予納洛酮快速戒斷建立嗎啡戒斷大鼠模型，隨后治療組采用電針穴位干預(yù)。戒斷后1、3、7d，分別采用戒斷癥狀評分表評定各組大鼠戒斷癥狀，應(yīng)用RT-PCR測定大鼠前額葉皮質(zhì)、伏隔核內(nèi)FosB基因的表達水平。結(jié)果：戒斷后各組癥狀評分顯示：與空白組比較，戒斷后1、3、7d模型組與電針組評分均明顯升高(P<0.01)，而隨戒斷時間增加模型與電針組評分均逐漸下降；與模型組比較，戒斷后1、3、7d電針組戒斷評分均明顯降低(P<0.01)；實時熒光定量PCR結(jié)果表明：戒斷后1、3、7d電針組大鼠伏隔核FosB mRNA表達較模型組顯著下降(P<0.01)，且呈先快后慢的趨勢；前額葉皮質(zhì)內(nèi)FosB mRNA表達較模型組下降(P<0.05)，但呈先慢后快的趨勢。結(jié)論：電針可以逐漸改善嗎啡戒斷后大鼠戒斷癥狀，同時下調(diào)不同腦區(qū)內(nèi)FosB mRNA的表達，且其表達變化規(guī)律在獎賞環(huán)路不同腦區(qū)內(nèi)存在差異。

嗎啡等成癮物質(zhì)導(dǎo)致的毒品問題是在世界范圍內(nèi)被廣泛關(guān)注的焦點。近年來，電針療法因其具有調(diào)理臟腑氣血、平衡體內(nèi)陰陽與促進內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用，成為藥物成癮治療、戒斷后焦慮、學(xué)習(xí)記憶能力下降等認知功能康復(fù)的重要干預(yù)手段[1-2]。然而，腦內(nèi)獎賞環(huán)路相關(guān)分子參與電針療法調(diào)控作用的具體機制尚未完全明確。隨著對成癮機制研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)很多與情感、記憶相關(guān)的重要腦區(qū)參與了藥物成癮尤其是精神依賴的形成，并誘發(fā)復(fù)吸[3]。研究顯示:前額葉皮層( Prefrontal cortex，PFC)、伏隔核(Nucleus accumbens, NAc)不僅參與了成癮的過程[4-5]，同時調(diào)節(jié)和控制著成癮后認知、行為和情緒的變化[6]。FosB mRNA為編碼FosB(FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B)蛋白的基因，是參與細胞增殖、分化與轉(zhuǎn)化的重要調(diào)控因子?，F(xiàn)已證實該基因編碼的蛋白及其剪接異構(gòu)體可通過神經(jīng)突觸可塑性的變化參與藥物成癮過程，并發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。本研究擬通過電針手段干預(yù)嗎啡戒斷大鼠，觀察戒斷后不同時期的癥狀及成癮相關(guān)腦區(qū)內(nèi)FosB mRNA表達的變化，為電針干預(yù)藥物成癮機制的實驗研究提供新的思路。

材料與方法

1 材料與儀器

1.1 實驗動物：本實驗所用動物為雄性 SD 大鼠54只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的，體重為(180±20) g。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，室內(nèi)溫度、濕度分別為 22℃、75%左右。

1.2 實驗儀器：KWD808Ⅱ脈沖治療儀；QL-902渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；Centrifuge 5415D離心機(Eppendorf)；NANODROP 2000分光光度計(Thermo scientific)；ABI7500熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.3 實驗試劑：鹽酸嗎啡注射液(10mg/ml，沈陽第一制藥廠，批號：H21022436)；鹽酸納洛酮注射液(1ml/1mg吉林敖東藥業(yè)集團股份有限公司，批號：H20066624)；超純RNA提取試劑盒(Cat# CW0581,CWbio.Co.Ltd)；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(Cat# CW0744,CWbio.Co.Ltd)；UltraSYBR Mixture(With ROX) (Cat# CW0956，CWbio.Co.Ltd)；DNase 1(Cat# CW2090，CWbio.Co.Ltd)；5x RNA Loading Buffer(Cat# CW0611A，CWbio.Co.Ltd )。

2 實驗方法

2.1 實驗分組：采用 transform 法設(shè)定隨機化方案，將54只大鼠分為空白組、模型組、電針組，每組各18只，每組再分為戒斷1、3、7d三個亞組，各6只。

2.2 造模方法：參照文獻[8]對模型組、電針組大鼠進行逐日遞增量背部皮下注射鹽酸嗎啡注射液，連續(xù)5d，劑量分別為( 20，30，40，50，50 mg/kg)，2次/d (8am，4pm)?？瞻捉M以相同體積、相同時間注射生理鹽水。嗎啡末次注射后3h給予納洛酮腹腔注射 (3 mg/kg) 快速戒斷。

2.3 戒斷癥狀量表評分：各組大鼠分別于造模后1、3、7 d進行戒斷癥狀量表評分。按照改良的柳田司知法進行，將各組大鼠放置在3000 ml燒杯中，觀察15 min內(nèi)大鼠戒斷癥狀及1 h后體重丟失情況。戒斷癥狀包括：濕狗樣抖動、齒顫、上瞼下垂、流淚、流涎、豎毛、激惹、腹瀉、跳躍及體重減輕，其中可數(shù)癥狀如濕狗樣抖動、跳躍次數(shù)及體重減輕依照發(fā)作次數(shù)評分，其他癥狀分別按照持續(xù)時間及嚴(yán)重程度分級評分，最后將各項評分加和得到最終戒斷評分的分數(shù)。

2.4 各組處理：造模后每日于各組大鼠評分后進行分組處置。電針組大鼠捆綁固定，針刺腎俞與足三里穴，連接電針治療儀，采用疏密波，頻率2/100 Hz，連接同側(cè)腎俞與足三里穴，電流強度以大鼠的下肢輕微抖動為度，每次15 min，每日1 次，連續(xù)治療7 d?？瞻捉M和模型組在相同時間相同方法捆綁固定。

2.5 實驗取材：各組大鼠分別于造模后1、3、7 d分組處置結(jié)束后斷頭，開顱，完整取出全腦組織，分離PFC及NAc腦區(qū)，液氮保存。

2.6 RT-PCR法測定PFC及NAc腦區(qū)的FosB基因表達水平：采用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；使用DNaseⅠ試劑盒進行消化處理以保證純度。引物設(shè)計：FosB(F:5’ -ACGCCTGGAGTTTGTCCTGGTG-3’ R:5’ - CCGTCTTCCTTAGCGGATGTTGA-3’產(chǎn)物大小126bp)；GAPDH(F:5’ - TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3’ R:5’ - TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3’產(chǎn)物大小138bp)。應(yīng)用試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄及擴增。擴增程序為：95°10min，(95℃15sec，60℃60sec)45個循環(huán)。用相對定量 2-△△Ct法計算各個樣品的基因相對表達量[9]。

結(jié) 果

1 電針對嗎啡戒斷后不同時間點戒斷癥狀的影響 見表1。戒斷后各組癥狀評分顯示：與空白組比較，戒斷后1、3、7 d模型組與電針組評分均明顯升高(P<0.01)，而隨戒斷時間增加模型與電針組評分均逐漸下降；與模型組比較，戒斷后1、3、7 d電針組戒斷評分均明顯降低(P<0.01)。

2 電針對造模后1、3、7 d各組大鼠PFC、NAc腦區(qū)FosB mRNA 表達水平的影響 見圖1。戒斷后大鼠PFC及NAc腦區(qū)內(nèi)FosB mRNA表達均下降。與空白組(設(shè)定為1. 00) 相比，戒斷后1、3、7d電針組大鼠伏隔核FosB mRNA表達較模型組顯著下降(P<0.01)，且呈先快后慢的趨勢；前額葉皮質(zhì)內(nèi)FosB mRNA表達較模型組下降(P<0.01)，但呈先慢后快的趨勢。

表1 各組大鼠不同時間戒斷癥狀評分比較(分)

注：與空白組比較，*P<0.01；與造模后1d比較，#P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

圖1 各組大鼠嗎啡戒斷后不同腦區(qū)FosB mRNA表達的變化

討 論

嗎啡是一種典型的阿片類藥物，長期應(yīng)用機體會對阿片類物質(zhì)產(chǎn)生代償性適應(yīng)，并涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)及其受體發(fā)生改變，可導(dǎo)致嚴(yán)重的戒斷癥狀并誘發(fā)復(fù)吸[10]。研究表明：當(dāng)人類腦部的獎賞系統(tǒng)在藥物或情緒、環(huán)境刺激等影響下發(fā)生障礙時，會導(dǎo)致相關(guān)腦區(qū)內(nèi)調(diào)控因子如FosB家族為代表的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的變化，因此上述基因有望成為此類病癥的潛在的治療靶點[11]。目前較為明確的獎賞環(huán)路腦區(qū)包括PFC、NAc以及海馬等[12-13]，在阿片類藥物的作用下，上述腦區(qū)通過多巴胺的作用被激活，從而對獎賞環(huán)路造成持續(xù)性的刺激，誘發(fā)突觸改變導(dǎo)致藥物成癮的發(fā)生，并可大致戒斷后的復(fù)吸。研究顯示:因成癮所導(dǎo)致的FosB等成癮相關(guān)基因表達變化還可以遺傳至子代導(dǎo)致出生后伏隔核等相關(guān)腦區(qū)內(nèi)基因的高表達[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)：電針作用于腎俞與足三里兩穴，不僅可以逐漸改善戒斷癥狀評分，同時還可有效調(diào)節(jié)不同腦區(qū)FosB mRNA的表達，可使戒斷后大鼠腦內(nèi)PFC與NAc腦區(qū)內(nèi)呈現(xiàn)不同規(guī)律的調(diào)節(jié)變化。上述變化與醫(yī)藥治療戒斷療效相一致[15]，可能是其發(fā)揮效果的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。在NAc區(qū)，當(dāng)成癮戒斷后該區(qū)域內(nèi)的FosB基因表達上調(diào)，而電針干預(yù)后顯著下降，隨著干預(yù)時間的延長，下調(diào)幅度明顯減慢。而PFC區(qū)的FosB基因表達也得到了電針的調(diào)節(jié)，呈現(xiàn)下降趨勢，但在干預(yù)早期即1-3d內(nèi)呈緩慢下降的趨勢，后期迅速下調(diào)。以上結(jié)果的出現(xiàn)可能與電針在戒斷后不同時期所發(fā)揮的作用相關(guān)，早期以減輕軀體癥狀為主，當(dāng)軀體癥狀得到改善后，逐漸增強了調(diào)控負責(zé)情緒與執(zhí)行能力腦區(qū)內(nèi)基因表達的作用。以上結(jié)果提示電針可有效干預(yù)戒斷癥狀，同時下調(diào)不同腦區(qū)內(nèi)FosB mRNA的表達，且其表達變化規(guī)律在獎賞環(huán)路不同腦區(qū)內(nèi)存在差異。

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(收稿：2016-09-20)

Effect of electroacupuncture on the expression of Fos B mRNA in different brain regions during Morphine withdrawal in rats

Liu Tiejuan, Chang Jiang, Wei Zhe.

The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University (Harbin 150001)

Objective: To observe rats’ withdrawal symptom and the expression of FosBmRNA in relative brain regions by electroacupuncture during Morphine withdrawal. Methods: Establish the Morphine dependent SD rat model. We adopted hypodermic injection by Morphine in back day by day, and injected naloxone in order to rapid withdrawal after the last injection of three hours. We treated the rats with electroacupuncture, and used withdrawal symptom scale to testing rats’ withdrawal symptom. The expression of FosB mRNA in PFC, and NAC of rats were measured by RT-PCR. Results: The withdrawal scores in electroacupuncture group was abbreviated obviously (P<0.01). The expression of FosB mRNA in NAC decreased in the electroacupuncture group (P<0.01), the changes of expression were rapid at first，and then becoming slow. Meanwhile, the expression of FosBmRNA in PFC were also decreased but the changes of expression were slow at first，and then becoming rapid. Conclusion: Electroacupuncture can improve the withdrawal symptoms and reducing the expression of FosBmRNA in the relative brain regions. But, the regulation mode was different.

Morphine dependence/therapy Substance withdrawal syndrome/therapy Genes/metabolism Animals,laboratory Rats

*國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目(81503639)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)新科學(xué)研究資助項目(2016LCZX49)

嗎啡依賴/治療 物質(zhì)戒斷綜合征/治療 基因/代謝 動物，實驗 大鼠

R749.61

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.001

黑龍江省自然科學(xué)基金面上項目(H2016070)

△通訊作者