孫舒嵐，李曉曦，蘇楠，都田趙，張桂榮

（中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室，沈陽110042）

NK細(xì)胞表面Fcγ受體3A的基因多態(tài)性對NK細(xì)胞功能的影響

孫舒嵐，李曉曦，蘇楠，都田趙，張桂榮

（中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，遼寧省腫瘤醫(yī)院中心實驗室，沈陽110042）

目的研究自然殺傷細(xì)胞（NK）表面Fcγ受體3A（FCGR3A）的基因多態(tài)性對NK細(xì)胞功能的影響。方法取患者外周血，利用實時PCR方法確定FCGR3A基因型，在曲妥珠單抗刺激下進(jìn)行體外培養(yǎng)。檢測各基因型的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)。同時檢測NK細(xì)胞表面活化受體表達(dá)及其ADCC活性。結(jié)果體外在曲妥珠單抗刺激下，F(xiàn)CGR3A野生型患者的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)是變異型的8倍左右。NK細(xì)胞活化受體表達(dá)及體外ADCC活性均高于變異型患者。結(jié)論體外實驗結(jié)果表明FCGR3A的基因多態(tài)性影響NK細(xì)胞功能及對單克隆抗體的應(yīng)答水平。

自然殺傷細(xì)胞；FCGR3A；基因多態(tài)性；曲妥珠單抗

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）表面的Fcγ受體3A（FCGR3A，CD16）存在單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymprphism，SNPs），按其第158個氨基酸V型=Valine（野生型）或者F型=Phenylalanin（突變型），可分為V/V、V/F及F/F型人群。V型FCGR3A從分子結(jié)構(gòu)上與曲妥珠單抗的Fc段可以更緊密地結(jié)合，而F型的受體，和抗體藥物的結(jié)合力較弱［1-2］。研究［3-4］表明，臨床上V/V型患者的無復(fù)發(fā)生存期要明顯高于V/F型和F/F型這兩種變異型患者，提示FCGR3A的基因多態(tài)性導(dǎo)致曲妥珠單抗的療效差異。

然而目前尚未有文獻(xiàn)報道FCGR3A基因多態(tài)性對NK細(xì)胞功能的影響。因此本研究將詳細(xì)解析FCGR3A基因多態(tài)性對NK細(xì)胞增殖、活化及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）功能的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人白血病細(xì)胞系細(xì)胞K562細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中；Her2陽性乳腺癌細(xì)胞系細(xì)胞BT-474培養(yǎng)于ATCC hybrid-care培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每3～4 d換液傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2 臨床樣本收集

選擇年齡≥18歲、Ⅰ～Ⅱ期Her2陽性乳腺癌、ECOG≤2、2個月內(nèi)未接受任何藥物或治療且簽署知情同意書的患者的入組。V/V型、V/F型及F/F型患者各10例。樣品采集：采集50 mL入組人群外周血，立刻進(jìn)行檢測及培養(yǎng)。

1.3FCGR3A的基因多態(tài)性檢測

以FCGR3A基因序列設(shè)計合成上下游引物。上游5’-CTGAAGACACATTTTTACTCCCAA（A/C）-3’，下游5’-TCCAAAAGCCACACTCAAAGAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為73 bp。并添加0.5 mmol/L dTNP，2 mmol/L MgSO4和1 U PlatinumRtaq High Fidelity polymerase及配套的High Fidelity PCR buffer。配置PCR反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件：95℃5 min；95℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，45個循環(huán)；72℃8 min。取實時PCR產(chǎn)物10 μL加5×上樣緩沖液4 μL 3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，拍照并進(jìn)行圖像分析。根據(jù)PCR結(jié)果將患者分為V/V型，V/F型和F/F型。

1.4 NK細(xì)胞培養(yǎng)

將曲妥珠單抗包被在無處理的細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，向其中加入從外周血中提取的單個核細(xì)胞，模擬曲妥珠單抗在體內(nèi)的刺激。培養(yǎng)周期為14 d。為了保證NK細(xì)胞的增殖活性，所有的培養(yǎng)體系中均加入白細(xì)胞介素2。

1.5 活化受體檢測

采集培養(yǎng)14 d的NK細(xì)胞，利用流式細(xì)胞分析儀檢測NK細(xì)胞活化受體的表達(dá)情況（包括NKp30，Nkp44，NKp46，NKG2D）。

1.6 CD107a表達(dá)檢測

將培養(yǎng)14 d的NK細(xì)胞與白血病細(xì)胞株K562以1∶1的比例混合，37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h。用流式細(xì)胞儀檢測NK細(xì)胞表面的CD107a表達(dá)。未與K562細(xì)胞混合的NK細(xì)胞CD107a表達(dá)作為基線。

1.7 曲妥珠單抗依賴性ADCC活性檢測

培養(yǎng)后的NK細(xì)胞與Her2陽性乳腺癌細(xì)胞系BT474細(xì)胞按一定效靶比例混合，同時添加600 ng/mL的曲妥珠單抗，單獨只有BT474細(xì)胞培養(yǎng)系作為陰性對照，添加TritonX的作為陽性對照。利用CCK8檢測試劑盒對曲妥珠單抗依賴性ADCC活性進(jìn)行檢測。對所得各組吸光光度值進(jìn)行計算，殺傷率=［1-（Aet-Ae）/At］×100%，其中A為單純效應(yīng)細(xì)胞孔即NK細(xì)胞孔的吸光光度值；At為單純靶細(xì)胞孔即BT474細(xì)胞孔的吸光光度值；Aet為效應(yīng)細(xì)胞加靶細(xì)胞孔的吸光光度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 利用實時PCR法確定FCGR3A的基因多態(tài)性

通過實時PCR方法檢測FCGR3A的基因多態(tài)性。根據(jù)FCGR3A第158個氨基酸可將FCGR3A分為V/V型，V/F型和F/F型。其中V/V型為野生型，V/F型和F/F型為突變型，見圖1。

圖1 通過實時PCR方法檢測FCGR3A的基因多態(tài)性Fig.1Analysis of FCGR3A polymorphisms by real-time PCR

2.2 對比曲妥珠單抗刺激后的V/V型、V/F型及F/F型患者的體外NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)

體外利用曲妥珠單抗刺激培養(yǎng)NK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)V/V型的NK細(xì)胞增殖率要高于V/F型或者F/F型的患者，是V/F型患者的2.68倍，是F/F型患者的8.25倍左右，見表1。并且曲妥珠單抗刺激后NK細(xì)胞（CD56+和CD3-）所占比例在V/V型和F/F型患者間更是相差甚遠(yuǎn)，見圖2。V/V型患者的培養(yǎng)體系中有78%的NK細(xì)胞，而F/F型患者培養(yǎng)體系中NK細(xì)胞只占3.9%。以上2項結(jié)果表明由于FCGR3A的基因多態(tài)性，嚴(yán)重影響了NK細(xì)胞的擴(kuò)增能力。

2.3 對比曲妥珠單抗刺激后的V/V型及F/F型患者的NK細(xì)胞活化受體表達(dá)水平

曲妥珠單抗刺激后的NK細(xì)胞表面活化受體表達(dá)在基因多態(tài)中也存在差別。NKp30，NKp46，NKG2D，CD107a的表達(dá)水平V/V型的患者均高于F/F患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。此結(jié)果說明由于FCGR3A的基因多態(tài)性，影響了NK細(xì)胞的活化程度。

表1 比較曲妥珠單抗刺激后NK細(xì)胞數(shù)及增殖率Tab.1Comparison of NK cell number and proliferation rate

表1 比較曲妥珠單抗刺激后NK細(xì)胞數(shù)及增殖率Tab.1Comparison of NK cell number and proliferation rate

1）P＜0.01 vs V/V group.

?

圖2 對比曲妥珠單抗刺激后NK細(xì)胞所占比例Fig.2Comparison of the NK cell percentage after trastumab stimulation

2.4 對比V/V型、V/F型及F/F型患者的體外曲妥珠單抗依賴性ADCC活性

圖3 對比曲妥珠單抗刺激后NK細(xì)胞活化受體表達(dá)水平Fig.3Comparison of expression of NK cell activating receptors after trastumab stimulation

3類患者培養(yǎng)后的NK細(xì)胞在效靶比為8的時候，檢測曲妥珠單抗依賴性ADCC活性，見圖4。V/V型患者NK細(xì)胞的ADCC活性要高于其余兩者。計算得到殺傷率結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）。雖然ADCC活性三者間并未有特別顯著的差距，然而考慮到NK細(xì)胞整體絕對值的差異，V/V型患者的抗腫瘤活性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于V/F型和F/F型患者。

圖4 對比V/V型、V/F型及F/F型患者的體外曲妥珠單抗依賴性ADCC活性Fig.4Comparison of trastumab-dependent NK cell cytotoxicity

3 討論

曲妥珠單抗聯(lián)合其他化療和激素療法可提升Her2陽性乳腺癌患者的臨床療效，改善生存期，然而單藥曲妥珠單抗的客觀有效率并不高，為12%～34%［5-7］。所以如何與曲妥珠單抗聯(lián)合治療，從而增強(qiáng)曲妥珠單抗的療效一直是研究的熱點。近年來的研究［8］表明，曲妥珠單抗的抗腫瘤效果主要來源于NK的ADCC作用，曲妥珠的臨床療效受體內(nèi)NK細(xì)胞活性影響很大，NK細(xì)胞治療聯(lián)合曲妥珠單抗可提高乳腺癌的臨床療效［9-11］，日漸被人們所認(rèn)識。

然而，臨床上曲妥珠單抗聯(lián)合NK細(xì)胞免疫療法對某些Her2過表達(dá)乳腺癌患者的療效有限。有研究表明，NK表面負(fù)責(zé)結(jié)合曲妥珠單抗FCGR3A的基因存在單核苷酸多態(tài)性，可能影響曲妥珠單抗的療效。野生型V/V型患者的無進(jìn)展生存期與總生存期也高于突變型V/F型或F/F型患者。V/F及V/V型人群在歐美占80%以上，在亞洲也有85%左右［12-14］，因此研究FCGR3A基因多態(tài)性對NK細(xì)胞功能影響為研究曲妥珠個體差異奠定理論基礎(chǔ)。

本研究表明，體外曲妥珠單抗刺激下，V/F型和F/F型這兩種突變型患者的NK細(xì)胞擴(kuò)增能力，活性及ADCC功能明顯低于V/V型患者。FCGR3A的基因多態(tài)性影響了NK細(xì)胞與曲妥珠單抗的結(jié)合能力，減弱了曲妥珠單抗的刺激信號，不僅降低了NK細(xì)胞在體內(nèi)的ADCC活性，同時還影響了NK細(xì)胞的增殖能力。這從另一個角度詮釋了V/F型和F/F型患者對曲妥珠單抗耐藥的原因。該研究結(jié)果為今后曲妥珠單抗適用人群的選定提供了理論支持。

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（編輯 于溪）

Effect of FCGR3A Polymorphisms on NK Cell Function

SUN Shulan，LI Xiaoxi，SU Nan，DU Tianzhao，ZHANG Guirong
（Central Laboratory，Cancer Hospital of China Medical University，Liaoning Cancer Hospital&Institute，Shenyang 110042，China）

ObjectiveTo investigate the effect ofFCGR3Apolymorphisms on NK cell function.MethodsPeripheral blood samples from cancer patients were collected andFCGR3Apolymorphisms were confirmed by PCR.In vitro proliferation rates，ADCC activity，and expression of NK cell activating receptors were compared under trastumab stimulation.ResultsThis study showed that the wild-typeFCGR3Aexhibited a higher affinity to trastumab along with better NK cell proliferation and ADCC activity than the mutant type.Compared to the patients with wild-type FCGR3A，the proliferation rates of NK cells in patients with the mutant type were reduced by approximately 8-fold.In addition，the expression of NK cell activating receptors in patients with wild-typeFCGR3Awas higher than in patients with the mutant type.ConclusionMutations inFCGR3Areduce NK cell function，causing a poor reaction to monoclonal antibody.

natural killer cell；FCGR3A；Polymorphisms；trastumab

R392.12

A

0258-4646（2017）05-0439-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.014

遼寧省科技廳博士啟動項目（201501109）

孫舒嵐（1984-），女，助理研究員，博士.

張桂榮，E-mail：zhang.lth@163.com

2017-01-05

網(wǎng)絡(luò)出版時間：