唐曉琳，潘春玲，李琛

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，沈陽(yáng)110002）

地塞米松對(duì)人牙周膜細(xì)胞白細(xì)胞介素6和白細(xì)胞介素8表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

唐曉琳，潘春玲，李琛

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，沈陽(yáng)110002）

目的探討地塞米松（Dex）對(duì)人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）中白細(xì)胞介素（IL）6和IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法Dex或牙齦卟啉單胞菌（P.g）-脂多糖（LPS）分6組處理hPDLCs:10-9mol/L Dex組，10-6mol/L Dex組，10 μg/mLP.g-LPS組，10-9mol/L Dex+ 10 μg/mLP.g-LPS組，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組，0.1%無(wú)水乙醇（對(duì)照組）。分別用ELISA法和實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-6、IL-8蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果24 h和48 h時(shí)，10-9mol/L Dex組和10-6mol/L Dex組IL-6和IL-8蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。48 h時(shí)10-9mol/L Dex組和10-6mol/L Dex組hPDLCsIL-6mRNA水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；而10-6mol/L Dex組IL-8mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。24 h和48 h時(shí)10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-6蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著低于10 μg/mLP.g-LPS組（P＜0.05）。24 h時(shí)10-9mol/L Dex+10 μg/mL P.g-LPS組和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-8蛋白表達(dá)水平顯著低于10 μg/mLP.g-LPS組（P＜0.05），但48 h未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。48 h時(shí)，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-8mRNA水平顯著高于10 μg/mLP.g-LPS組（P＜0.05）。結(jié)論Dex可以顯著抑制hPDLCs固有的和P.g-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6的表達(dá)，但是Dex對(duì)hPDLCs IL-8的表達(dá)具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，需注意高濃度Dex長(zhǎng)時(shí)間作用時(shí)對(duì)hPDLCs IL-8表達(dá)的促進(jìn)作用。

地塞米松；糖皮質(zhì)激素；牙周膜細(xì)胞；骨向誘導(dǎo)；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素8

牙周炎是一種發(fā)生在牙周組織的慢性炎癥性疾病，主要特點(diǎn)是牙周袋形成和牙槽骨吸收。人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是牙周組織的重要細(xì)胞，在特定條件下可以分化為成骨細(xì)胞，進(jìn)而修復(fù)牙周組織。此外，hPDLCs在細(xì)菌及其毒力因子作用下可以分泌白細(xì)胞介素（interleukin，IL）6和IL-8等多種促炎性因子［1］。眾所周知，糖皮質(zhì)激素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和免疫炎癥反應(yīng)。地塞米松（dexamethasone，Dex）是一種常見的人工合成糖皮質(zhì)激素。Dex主要用于牙周組織工程學(xué)研究，即誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞骨向分化為成骨細(xì)胞［2-4］；其次，在牙周治療中可作為止痛輔劑［5］。但是Dex對(duì)hPDLCs促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究的目的是觀察Dex和牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）-脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對(duì)hPDLCs IL-6和IL-8表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用，從而為Dex的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Dex（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（德國(guó)PAA公司）；活性炭處理胎牛血清（天津?yàn)笊镏破芳夹g(shù)有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司）；ELISA試劑盒、Trizol試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；P.g-LPS（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙體牙髓科仇麗鴻教授惠贈(zèng)）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Rad公司）；實(shí)時(shí)定量PCR試劑（日本Takara公司）。

1.2 hPDLCs原代培養(yǎng)

細(xì)胞來源于3名正畸治療患者的前磨牙。術(shù)前獲得患者的知情同意。采用組織塊法行hPDLCs原代培養(yǎng)［6］。個(gè)體來源細(xì)胞培養(yǎng)至第3代后混合，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3P.g-LPS提取

熱酚水法提取P.gATCC 33277 LPS，凍干得LPS精制品，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Dex和P.g-LPS處理方法和分組

Dex溶解于無(wú)水乙醇中，-70℃凍存?zhèn)溆?。消化?代細(xì)胞，2×104/孔接種于24孔板（為第5代），在去酚紅DMEM培養(yǎng)基和5%活性炭處理的胎牛血清中培養(yǎng)至第8天，分為6組處理：10-9mol/L Dex組，10-6mol/L Dex組，10 μg/mLP.g-LPS組，10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組，10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組，對(duì)照組（培養(yǎng)基中加入0.1%無(wú)水乙醇），每組重復(fù)6孔。

1.5 ELISA法檢測(cè)hPDLCs IL-6和IL-8蛋白的表達(dá)水平

在上述處理24 h和48 h時(shí)收集培養(yǎng)基，1 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液，-70℃凍存待檢。依據(jù)IL-6和IL-8試劑盒說明，ELISA法檢測(cè)上清液中的IL-6和IL-8含量。酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)讀取光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清中IL-6和IL-8含量。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-6和IL-8mRNA表達(dá)水平

各種因素處理細(xì)胞48 h，按照試劑盒說明，用Trizol試劑裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-6和IL-8mRNA表達(dá)水平，GAPDH做為內(nèi)參照。引物序列：IL-6，上游引物5’-GGAGACTTGCCTGGTGAAA-3’，下游引物5’-CAGGGGTGGTTATTGCATCT-3’，產(chǎn)物片段179 bp；IL-8，上游引物5’-AGCTCTGTGTG AAGGTGCAG-3’，下游引物5’-AATTTCTGTGTTGG CGCAGT-3’，產(chǎn)物片段148 bp；GAPDH，上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAA GATGGTGATGGGATTTC-3’，產(chǎn)物片段226 bp。目的基因mRNA表達(dá)水平的計(jì)算方法為相對(duì)定量法，計(jì)算公式為2-ΔΔCT。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dex對(duì)hPDLCs固有IL-6和IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

10-9mol/L Dex組和10-6mol/L Dex組IL-6蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（均P＜0.001），24 h時(shí)分別為對(duì)照組的42.52%和15.49%，48 h分別為對(duì)照組的23.86%和6.59%。48 h時(shí)，10-9mol/L Dex組和10-6mol/L Dex組IL-6mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（均P＜0.001），分別為對(duì)照組的53.10%和10.13%。見表1。

10-9mol/L Dex組或10-6mol/L Dex組IL-8蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（均P＜0.001），24 h時(shí)分別為對(duì)照組的32.51%和24.67%；48 h分別為對(duì)照組的37.77%和53.84%。48 h時(shí)10-6mol/L Dex組IL-8mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P=0.016），為對(duì)照組的2.74倍。見表1。

2.2P.g-LPS對(duì)hPDLCs IL-6和IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

10 μg/mLP.g-LPS組IL-6蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（均P＜0.001），24 h時(shí)為對(duì)照組的9.08倍，48 h時(shí)為對(duì)照組的4.82倍。48 h時(shí)10 μg/mLP.g-LPS組IL-6mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），為對(duì)照組的8.97倍。見表1。

10 μg/mLP.g-LPS組IL-8蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（均P＜0.001），24 h時(shí)為對(duì)照組的28.15倍，48 h為對(duì)照組的37.53倍。48 h時(shí)10 μg/mLP.g-LPS組IL-8mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），為對(duì)照組的74.64倍。見表1。

2.3 Dex和P.g-LPS聯(lián)合作用對(duì)hPDLCs IL-6和IL-8表達(dá)的影響

10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組或10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-6蛋白的表達(dá)水平均顯著低于10 μg/mLP.g-LPS組（均P＜0.001），24 h時(shí)分別為10 μg/mLP.g-LPS組的72.00%和37.30%，48 h時(shí)分別為10 μg/mLP.g-LPS組的84.64%和 66.85%。48 h時(shí)10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組（P=0.014）和10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組（P=0.009）IL-6mRNA表達(dá)水平顯著低于10 μg/mLP.g-LPS組，分別為10 μg/mLP.g-LPS組的38.56%和27.03%。見表1。

24 h時(shí)10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組或10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-8蛋白的表達(dá)水平均顯著低于10 μg/mLP.g-LPS組（均P＜0.001），分別為10 μg/mLP.g-LPS組的68.29%和69.45%。但48 h時(shí)，Dex對(duì)10 μg/mLP.g-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8蛋白表達(dá)未見顯著作用。48 h時(shí)10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS組IL-8mRNA表達(dá)水平顯著高于10 μg/mLP.g-LPS組（P＜0.001），為10 μg/mLP.g-LPS單獨(dú)作用的3.95倍。見表1。

表1 Dex和P.g-LPS對(duì)hPDLCs IL-6和IL-8蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用Tab.1Effects of Dex and P.g-LPS on IL-6 and IL-8 protein expression in hPDLCs

3 討論

Dex在牙周領(lǐng)域的應(yīng)用主要為誘導(dǎo)牙周干細(xì)胞骨向分化，很少用于治療牙周炎癥反應(yīng)。筆者推測(cè)，局部應(yīng)用Dex可以避免全身應(yīng)用的諸多不良反應(yīng)［7］，一方面能夠誘導(dǎo)hPDLCs細(xì)胞骨向分化，另一方面可以發(fā)揮調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。但是局部應(yīng)用Dex對(duì)牙周炎的調(diào)節(jié)作用尚存在爭(zhēng)議［8-9］。本研究以hPDLCs為研究對(duì)象，探討Dex對(duì)促炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用和劑量選擇。

IL-6積極參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程，具有促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟、抑制牙周膜再生、促進(jìn)炎癥反應(yīng)等多項(xiàng)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex強(qiáng)烈抑制hPDLCs固有的和P.g-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6蛋白和mRNA的表達(dá)，從而可能抑制牙周炎癥反應(yīng)。NEBEL等［10］的研究發(fā)現(xiàn)，Dex顯著抑制大腸桿菌LPS誘導(dǎo)的hPDLCs IL-6的表達(dá)，但是未探討Dex對(duì)hPDLCs固有IL-6表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。此外，NEBEL等［10］的研究中未發(fā)現(xiàn)1～5 μg/mLP.g-LPS對(duì)hPDLCs的調(diào)節(jié)作用，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10 μg/mLP.g-LPS能顯著促進(jìn)hPDLCs IL-6蛋白和mRNA的表達(dá)，且與更高濃度LPS組比較細(xì)胞的狀態(tài)未發(fā)生顯著變化，因此選擇該濃度。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示，P.g-LPS通過多種途徑促進(jìn)IL-6的表達(dá)，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路［11］、核因子κB通路［12］、miRNA-146分子［13］等。ANTON等［14］發(fā)現(xiàn)Dex能夠抑制MAPK的活化，進(jìn)而抑制LPS刺激絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞IL-6和IL-8的表達(dá)。但是在hPDLCs中，Dex調(diào)節(jié)IL-6表達(dá)的具體途徑還需要深入研究。

IL-8是人白細(xì)胞趨化和活化因子家族成員，研究證實(shí)IL-8在牙周炎的炎癥進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［15-16］。本研究結(jié)果顯示，Dex對(duì)IL-8具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex對(duì)hPDLCs固有IL-8蛋白有顯著的抑制作用，但是48 h時(shí)高濃度（10-6mol/L）Dex組IL-8蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著高于10-9mol/L Dex組，IL-8mRNA水平顯著高于對(duì)照組。此外，雖然Dex作用24 h顯著抑制P.g-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-8蛋白水平，但是48 h時(shí)Dex對(duì)P.g-LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8蛋白的抑制作用消失，且10-6mol/L Dex強(qiáng)烈促進(jìn)P.g-LPS誘導(dǎo)IL-8mRNA的表達(dá)。

本研究中，培養(yǎng)基上清液中檢測(cè)到的IL-8蛋白和細(xì)胞中IL-8mRNA表達(dá)的趨勢(shì)不甚一致，主要是由檢測(cè)方法導(dǎo)致。本研究中通過ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基上清中的IL-8水平，由于早期Dex對(duì)細(xì)胞IL-8蛋白的顯著抑制作用，導(dǎo)致Dex組上清液中IL-8水平較低，而隨后Dex雖然可能促進(jìn)了IL-8蛋白的表達(dá)，但是未能抵消原有的抑制量，所以未能檢測(cè)出Dex對(duì)IL-8蛋白的促進(jìn)作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)48 h時(shí)10-6mol/L Dex組IL-8蛋白和mRNA水平都顯著高于10-9mol/L Dex組，且Dex對(duì)LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8蛋白的抑制作用消失，也可以提示48 h時(shí)10-6mol/L Dex對(duì)IL-8蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。根據(jù)LEE等［17］的報(bào)道，Dex能顯著抑制MAPK途徑，進(jìn)而抑制hPDLCs中腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)，但是僅檢測(cè)了24 h時(shí)間點(diǎn)，未對(duì)48 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，因此無(wú)法與本研究的結(jié)果類比。此外，SADIKOT等［18］研究顯示，高劑量Dex能夠增強(qiáng)內(nèi)毒素處理小鼠核因子κB活性，從而促進(jìn)炎癥發(fā)生。AGRAWAL等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，Crohn病患者全身應(yīng)用Dex能夠增加腹腔內(nèi)和盆腔內(nèi)膿腫的危險(xiǎn)性。根據(jù)本研究結(jié)果，Dex對(duì)IL-8表達(dá)的調(diào)節(jié)具有雙向作用。短時(shí)間內(nèi)Dex可能抑制IL-8的表達(dá)，而高濃度Dex長(zhǎng)時(shí)間作用可能促進(jìn)內(nèi)源性和LPS誘導(dǎo)的IL-8的表達(dá)，但是具體機(jī)制還需要深入研究。

本研究中應(yīng)用的特定實(shí)驗(yàn)條件考慮了如下因素。本研究在細(xì)胞培養(yǎng)至第8天后施加各種處理因素，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)已到達(dá)平臺(tái)期，可以排除Dex對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。Dex是骨向誘導(dǎo)劑的重要成分，以往研究報(bào)道的濃度范圍為10-9～10-6mol/L，因此本研究應(yīng)用這一濃度范圍處理細(xì)胞。研究中采用去酚紅DMEM培養(yǎng)基和活性炭處理胎牛血清，能夠最大限度降低培養(yǎng)體系中激素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。為了增強(qiáng)可比性，24 h和48 h的檢測(cè)結(jié)果均來源于同一批細(xì)胞。所以僅在處理結(jié)束即48 h時(shí)，對(duì)裂解細(xì)胞進(jìn)行了mRNA檢測(cè)。

綜上所述，Dex能夠顯著抑制IL-6的表達(dá)，從而可能抑制牙周炎癥反應(yīng)。但是，Dex對(duì)IL-8的調(diào)節(jié)作用較為復(fù)雜，具有雙向性，特別是高濃度Dex長(zhǎng)時(shí)間作用可能促進(jìn)IL-8的表達(dá)進(jìn)而可能促進(jìn)炎癥反應(yīng)。因此，在臨床應(yīng)用時(shí)需要注意Dex的合理濃度范圍。今后尚需研究Dex對(duì)hPDLCs IL-6和IL-8表達(dá)調(diào)節(jié)的具體機(jī)制，并探討體內(nèi)應(yīng)用方式。

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（編輯 陳姜）

Effect of Dexamethasone on the Expression of Interleukin-6 and Interleukin-8 in Human Periodontal Ligament Cells

TANG Xiaolin，PAN Chunling，LI Chen
（Department of Periodontology，School of Stomatology，China Medical University，Shenyang 110002，China）

ObjectiveTo explore the effect of dexamethasone（Dex）treatment on the expression of interleukin（IL）-6 and IL-8 in human periodontal ligament cells（hPDLCs）.MethodshPDLCs were subjected to one of the following treatments for 24 h or 48 h:10-9mol/L Dex；10-6mol/L Dex；10 μg/mLPorphyromonas gingivalis（P.g）-lipopolysaccharide（LPS）；10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS；10-6mol/L Dex+10 μg/mL P.g-LPS；or 0.1%absolute ethyl alcohol（control）.Protein and mRNA expression was detected using ELISA and real-time PCR，respectively.ResultsAt 24 h and at 48 h，IL-6 and IL-8 protein expression in the 10-9mol/L Dex-and 10-6mol/L Dex-treated groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05）.At 48 h，IL-6mRNA expression in the 10-9mol/L Dex-and 10-6mol/L Dex-treated groups was significantly lower than that in the control group（P＜0.05），whileIL-8mRNA expression in the 10-6mol/L Dex-treated group was significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.At 24 h and at 48 h，IL-6 protein and mRNA expression in the 10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group and the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly lower than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05）.At 24 h，IL-8 protein expression in the 10-9mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group and the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly lower than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05），while no such significant difference existed at 48 h.At 48 h，IL-8mRNA expression in the 10-6mol/L Dex+10 μg/mLP.g-LPS-treated group was significantly higher than that in the 10 μg/mLP.g-LPS-treated group（P＜0.05）.ConclusionDex inhibits the innate andP.g-LPS-induced expression of IL-6 in hPDLCs.However，Dex exerts profound effects on IL-8 expression，and treatment with high doses of Dex may promote IL-8 expression over an extended period.

dexamethasone；glucocorticoid；periodontal ligament cell；osteogenic induction；interleukin-6；interleukin-8

R781.4

A

0258-4646（2017）05-0449-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.016

中國(guó)博士后科學(xué)基金（20090461190）

唐曉琳（1973-），女，副教授，博士. E-mail：xltang@cmu.edu.cn

2016-12-29

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