桑亮，王學(xué)梅，許東陽，桑力軒，商功群，袁勝美，屠樹星

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.超聲科；2.老年醫(yī)學(xué)科，沈陽110001）

超聲量化指標(biāo)預(yù)測大鼠肝纖維化嚴(yán)重程度

桑亮1，王學(xué)梅1，許東陽1，桑力軒2，商功群1，袁勝美1，屠樹星1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.超聲科；2.老年醫(yī)學(xué)科，沈陽110001）

目的利用四氯化碳（CCl4）復(fù)制大鼠肝纖維化模型，通過logistic回歸探討超聲量化指標(biāo)對肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測能力。方法40%CCl4復(fù)制大鼠肝纖維化模型，超聲檢測門靜脈內(nèi)徑、血流速度及楊氏模量。大鼠肝組織HE染色，光鏡下判定肝纖維化程度。結(jié)果門靜脈內(nèi)徑、楊氏模量在肝纖維化嚴(yán)重程度判定中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中楊氏模量對肝纖維化嚴(yán)重程度判定預(yù)測能力最大，R2值為0.788。楊氏模量聯(lián)合門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑可以有效提高預(yù)測能力，R2值均為0.821。結(jié)論楊氏模量是單因素預(yù)測肝纖維化嚴(yán)重程度能力最大的指標(biāo)，多指標(biāo)聯(lián)合能有效提高對肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測能力。

大鼠；肝纖維化；剪切波彈性成像；logistic回歸

肝纖維化是肝內(nèi)纖維組織的過度增生，是一系列肝病發(fā)展演變的中間階段［1］，其嚴(yán)重程度的判定在肝病的診療中具有重要意義［2］。常規(guī)超聲多以肝實(shí)質(zhì)回聲改變判定肝纖維化，受機(jī)器、人為因素影響，判定存在主觀性，不能準(zhǔn)確定量判定［3］。實(shí)時(shí)剪切波彈性成像技術(shù)（shear wave elastrography，SWE）檢測肝臟楊氏模量為無創(chuàng)性判定肝纖維化程度提供了定量檢測的新方法。本研究通過四氯化碳（CCl4）復(fù)制大鼠肝纖維化模型，以病理為金標(biāo)準(zhǔn)，利用logistic回歸分析，判定門靜脈內(nèi)徑、門靜脈血流速度、SWE楊氏模量等量化指標(biāo)對肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，雄性，健康，清潔級，體質(zhì)量（200±20）g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均分籠飼養(yǎng)，普通飼料喂養(yǎng)、自由進(jìn)水。

1.2 方法

1.2.1 CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型的建立：于實(shí)驗(yàn)開始第0、2、4、6周分別購入大鼠15、15、10、10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。造模采用橄欖油將CCl4配成40%的溶液，首次按1 mL/kg劑量經(jīng)腹腔注射，以后每周2次按2 mL/kg劑量給藥。于造模開始第8周末最后1次給藥，禁食水24 h后行肝臟超聲檢查。

1.2.2 大鼠肝臟超聲檢查：

1.2.2.1 檢查前準(zhǔn)備大鼠稱重并記錄，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，電動剃發(fā)刀去除腹部體毛。

1.2.2.2 超聲儀器應(yīng)用法國聲科Supersonic彩色超聲診斷儀，配有實(shí)時(shí)SWE功能，選用線陣探頭，探頭頻率4～15 MHz。

1.2.2.3 超聲檢測（1）門靜脈內(nèi)徑，二維條件下清晰顯示門靜脈主干，凍結(jié)圖像，測量距門靜脈起始部約0.5～0.75 cm和1.5～2.0 cm處門靜脈內(nèi)徑，分別標(biāo)記為門靜脈近段內(nèi)徑和門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑，各測量3次，取平均值（圖1A、1B）。（2）門靜脈血流速度，二維條件下清晰顯示門靜脈主干，開啟CDFI模式，血流信號顯示穩(wěn)定后打開PW模式，頻譜穩(wěn)定狀態(tài)下凍結(jié)圖像，測量門靜脈血流速度，連續(xù)測量3次，取平均值（圖1C）。（3）實(shí)時(shí)SWE檢測肝組織楊氏模量，二維條件下清晰顯示肝臟右葉或左葉，開啟SWE模式，圖像穩(wěn)定后凍結(jié)圖像，選取感興趣區(qū)域測量彈性值，以kPa為單位。圖像以感興趣區(qū)域填充均勻一致的藍(lán)色時(shí)為準(zhǔn)。啟動儀器提供的Q-BOX功能測量成像區(qū)域內(nèi)的肝臟楊氏模量值，設(shè)定量程為180 kPa，Q-BOX區(qū)域直徑為3 mm，測量3次并記錄楊氏模量平均值（圖1D）。

圖1 超聲量化指標(biāo)Fig.1Quantitative ultrasound indexes

1.2.3 病理學(xué)檢查：大鼠肝組織以10%甲醛固定48 h以上，石蠟包埋，間距4 μm連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡下觀察、采集圖像。肝纖維化病理診斷由病理科專業(yè)醫(yī)生參照《病毒性肝炎防治方案》［4］中的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)匯管區(qū)及周圍纖維化情況及小葉結(jié)構(gòu)，將纖維化程度分為S0～S4期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以病理肝纖維化分期為依據(jù)進(jìn)行分組，計(jì)量資料用x±s表示。組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法LSD-t檢驗(yàn)。肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測采用有序logistic回歸分析。全部數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型的一般情況及病理改變

2.1.1 動物模型的一般情況：大鼠造模過程中死亡8只，隨著造模周期延長出現(xiàn)進(jìn)食差，色黃脫毛，運(yùn)動遲緩，體質(zhì)量增加緩慢。

2.1.2 動物模型大體標(biāo)本及病理改變：S0期8只，S1期5只，S2期9只，S3期11只，S4期9只；造模10周以S4期為主，8周以S3期為主，6周以S2期為主，4周以S1期為主。造模4周大鼠肝臟被膜緊張，形態(tài)飽滿，光鏡下肝細(xì)胞存在點(diǎn)狀、灶狀壞死，小葉內(nèi)局限性纖維化（圖2A、2B）。造模8周大鼠肝臟表面不平、皺縮，可見結(jié)節(jié)改變，光鏡下正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉清晰可見（圖2C、2D）。

圖2 大鼠造模4周和8周時(shí)大體標(biāo)本及病理改變Fig.2Gross specimen and pathological changes in rats at week 4 and week 8

2.2 大鼠超聲檢查結(jié)果對照病理

2.2.1 大鼠門靜脈近段內(nèi)徑及遠(yuǎn)段內(nèi)徑：門靜脈近段內(nèi)徑與門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑在出現(xiàn)肝纖維化后整體呈增寬趨勢（近段內(nèi)徑S1期除外），但S1～S2期與S0期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），S3～S4期與S0～S2期以及S4期與S3期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2.2 大鼠門靜脈血流速度：門靜脈血流速度在S1期比S0期明顯升高，隨著肝纖維化加重呈下降趨勢，到早期肝硬化（S4期）甚至低于S0期。其中S1期與S0期、S3～S4期與S1期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同肝纖維化分期超聲檢查結(jié)果對照情況Tab.1Ultrasound results comparing different stages of liver fibrosis

2.2.3 大鼠肝臟SWE楊氏模量：SWE楊氏模量表現(xiàn)出隨肝纖維化程度加重呈上升趨勢，且S1～S4期與S0期比較以及S3～S4期與S1～S2期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而S1期與S2期以及S3期與S4期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 logistic回歸分析預(yù)測肝纖維嚴(yán)重程度

根據(jù)以上結(jié)果，按照肝纖維化嚴(yán)重程度將實(shí)驗(yàn)大鼠重新分組，分為無肝纖維組（S0期）、輕度肝纖維化組（S1、S2期）、明顯肝纖維化組（S3、S4期），進(jìn)行單因素及多因素聯(lián)合有序logistic回歸分析，判斷研究指標(biāo)在肝纖維化病理改變嚴(yán)重程度中的預(yù)測能力。

2.3.1單因素有序logistic回歸：本研究各個(gè)指標(biāo)除門靜脈血流速度外，在肝纖維化嚴(yán)重程度判定中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中SWE楊氏模量對肝纖維化嚴(yán)重程度判定預(yù)測能力最大，R2值為0.788，回歸方程分別為Y=15.615+1.576X和Y=23.799+ 1.576X。見表2。

表2 單因素有序logistic回歸分析結(jié)果Tab.2Single factor ordinal logistic regression analysis

2.3.2 聯(lián)合有序logistic回歸：根據(jù)單因素有序logistic回歸分析結(jié)果，聯(lián)合SWE楊氏模量與門靜脈內(nèi)徑進(jìn)行有序logistic回歸分析，R2值升高，但僅在SWE楊氏模量聯(lián)合門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），R2為0.821，回歸方程為Y=29.397+ 1.724X1+56.103X2，Y=39.143+1.724X1+56.103X2。見表3。

表3 多因素聯(lián)合有序logistic回歸分析結(jié)果Tab.3Multiple factor ordinal logistic regression analysis

3 討論

肝組織活檢對肝纖維化判定最為可靠，然而肝活檢會對受檢者產(chǎn)生創(chuàng)傷或潛在風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重時(shí)危及生命，較難作為隨訪和療效觀察的指標(biāo)［5］。超聲在肝臟疾病中應(yīng)用最為普及，但無論敏感度還是特異度都差強(qiáng)人意［6］。當(dāng)肝組織出現(xiàn)纖維化時(shí)其硬度可能已經(jīng)增加，組織彈性下降，從而通過組織硬度變化反映肝纖維化程度［7］。SWE技術(shù)通過檢測組織內(nèi)剪切波的速度獲得楊氏模量這一代表組織硬度的參數(shù)，反映組織硬度［8］。本研究結(jié)果顯示，大鼠的肝臟楊氏模量值隨肝纖維化程度的加重有增高趨勢，與文獻(xiàn)［9-10］報(bào)道的結(jié)果一致，說明SWE測得的肝彈性模量值能夠反映肝組織硬度的變化。S1期與S2期以及S3期與S4期組間比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示SWE適用于肝纖維化嚴(yán)重程度的判斷，但對肝纖維化分期的判定尚存在局限性。POYNARD等［11］的研究結(jié)果大致如此，這可能與肝纖維化病理連續(xù)變化有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化的加重門靜脈近段（除S1期）與遠(yuǎn)段內(nèi)徑均有增寬的趨勢，但在輕中度肝纖維化時(shí)門靜脈內(nèi)徑變化并不明顯，對肝纖維化的提示意義不大，當(dāng)發(fā)展到重度纖維化或早期肝硬化時(shí)，門靜脈則出現(xiàn)較明顯的增寬，可以起到很好的臨床提示作用。既往研究［12］發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，慢性肝炎患者門靜脈主干直徑逐漸擴(kuò)張。這可能由于肝組織纖維間隔收縮，肝內(nèi)膽管周圍纖維組織及膽汁不同程度的淤積加重肝小葉周圍的機(jī)械壓力，同時(shí)由于側(cè)支循環(huán)建立，高壓的肝動脈血流入低壓的門靜脈內(nèi)會使門靜脈壓力增高所致。

肝組織損傷和修復(fù)理論上會導(dǎo)致肝臟微循環(huán)動力學(xué)變化。HIRATA等［13］的研究結(jié)果表明隨著肝纖維化加重門靜脈阻力提升，流速會不同程度下降，但BEMATIK等［14］通過研究不同程度肝病患者發(fā)現(xiàn)Doppler超聲不能很好的提示嚴(yán)重性。本研究結(jié)果表明，在肝纖維化S1期門靜脈血流速度比S0期明顯升高，隨著肝纖維化的加重呈下降趨勢。Doppler超聲對于判定肝纖維化存在較大差異，可能由于取樣角度不同，加之不同作者對采樣位置的選擇也難以保證完全一致［15-16］。

目前研究證實(shí)很多指標(biāo)與肝纖維化存在相關(guān)性，但針對肝纖維化嚴(yán)重程度預(yù)測的報(bào)道少見。本研究通過有序logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，在超聲量化指標(biāo)中，實(shí)時(shí)SWE楊氏模量的R2值為0.778，對肝纖維化有很高的預(yù)測能力，可以作為單獨(dú)指標(biāo)進(jìn)行肝纖維化判定，今后可以通過臨床病例分析獲得肝纖維化嚴(yán)重程度有效的診斷預(yù)測值。另外通過對研究指標(biāo)進(jìn)行多因素有序logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合多項(xiàng)指標(biāo)能提高肝纖維化嚴(yán)重程度的預(yù)測能力，本研究中實(shí)時(shí)SWE聯(lián)合門靜脈遠(yuǎn)段內(nèi)徑R2值為0.821，高于任何單一因素的預(yù)測能力?？梢栽诮窈蟮呐R床研究中通過回歸分析建立簡單有效的回歸方程，準(zhǔn)確的預(yù)測肝纖維化嚴(yán)重程度，指導(dǎo)臨床治療與預(yù)后的觀察。但是研究存在一些不足之處：研究樣本量少，可能導(dǎo)致不同肝纖維化分期間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差；局限于實(shí)驗(yàn)研究，大鼠模型與臨床對象肝纖維化病理改變存在差異，下一步應(yīng)加入臨床資料研究。

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（編輯 陳姜）

Prediction of the Severity of Liver Fibrosis in Rats Using Quantitative Ultrasound Index

SANG Liang1，WANG Xuemei1，XU Dongyang1，SANG Lixuan2，SHANG Gongqun1，YUAN Shengmei1，TU Shuxing1
（1.Department of Ultrasound，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Geriatrics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo assess the ability of quantitative ultrasound index to predict the severity of CCl4-induced liver fibrosis in a rat model using logistic regression analysis.MethodsIn a rat model of 40%CCl4-induced liver fibrosis，ultrasound detected the portal vein diameter，blood flow velocity，and Young’s modulus.The degree of hepatic fibrosis was determined using a light microscope after hematoxylin and eosin staining of tissue.ResultsPortal vein diameter and Young’s modulus were useful predictors of the severity of liver fibrosis，with statistical significance（P＜0.05）.Young’s modulus was most effective with anR2value 0.788.Young’s modulus combined with the distal diameter of portal vein effectively improved the predictive ability，showing anR2value 0.821.ConclusionYoung’s modulus is the most predictive index to assess the severity of liver fibrosis.A combination of multiple indices can improve the ability to predict the severity of liver fibrosis.

rat；liver fibrosis；shear wave elastrography；logistic regression

R445.1

A

0258-4646（2017）05-0429-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.012

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（2015020515）

桑亮（1983-），男，主治醫(yī)師，博士.

王學(xué)梅，E-mail：wxmlmt@163.com

2016-10-10

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