周立霞，吳月明，李娜

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧錦州121000）

色素上皮源性因子通過血管內(nèi)皮生長因子抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展

周立霞，吳月明，李娜

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科，遼寧錦州121000）

目的檢測A549中色素上皮源性因子（PEDF）通過血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）影響細(xì)胞的增殖與遷移的方式。方法過表達(dá)或沉默PEDF后觀察其對VEGF的影響。MTT與trasnwell檢測PEDF對細(xì)胞增殖和遷移的作用。實(shí)時(shí)PCR及Western blotting檢測PEDF如何調(diào)節(jié)VEGF/SRC/FAK通路。結(jié)果PEDF可抑制VEGF，進(jìn)而抑制A549細(xì)胞的增殖與遷移。結(jié)論P(yáng)EDF可能成為肺癌的潛在診療靶點(diǎn)。

非小細(xì)胞肺癌；血管內(nèi)皮生長因子；A549；色素上皮源性因子

肺癌被認(rèn)為是目前全世界對人類健康與生命威脅最大的惡性腫瘤［1］。色素上皮源性因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是一種分泌型糖蛋白，在多種腫瘤中都存在表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，主要功能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和新生血管生成等［2-3］。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是具有旁分泌功能的生長因子，與實(shí)體腫瘤生長關(guān)系密切［4-6］。

本研究探討了PEDF通過影響VEGF與其下游SRC/FAK通路調(diào)控A549細(xì)胞增殖與遷移的方式，以期待由此能找到診療非小細(xì)胞肺癌的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺癌A549細(xì)胞株（實(shí)驗(yàn)室凍存），DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），trizol、氯仿、異丙醇（上海生工生物工程股份有限公司）?？贵w：PEDF，VEGF，SRC，SRCp-Tyr418，F(xiàn)AK，F(xiàn)AKp-Tyr397，cyclin D1，caspase 3，paxillin和GAPDH（Santa公司，美國），SYBR Green（Promega公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞至對數(shù)生長期。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：分別將PEDF質(zhì)?；騊EDF silence小鏈（吉凱，上海）轉(zhuǎn)染到處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h后，分別于0 h，12 h，24 h，36 h和48 h使用MTT方法測量細(xì)胞增殖情況，在490 nm處記錄吸光值。

1.2.3 Western blotting：RIPA裂解液裂解組織或轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒或小鏈24 h的細(xì)胞后，取等量蛋白上樣，通過SDS-PAGE電泳（80～120 V）、轉(zhuǎn)膜（100 V，1 h）、封閉后（5%奶粉，1 h），一抗4℃過夜，二抗室溫1 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)比較使用非配對t檢驗(yàn)分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞系中PEDF調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)及其下游通路蛋白的表達(dá)

A549細(xì)胞系中PEDF負(fù)向調(diào)節(jié)VEGF及其下游SRC/FAK通路的磷酸化水平。當(dāng)在A549細(xì)胞系中過表達(dá)PEDF時(shí)，VEGF的表達(dá)以及其下游SRC/FAK通路蛋白的磷酸化水平受到一定程度的抑制，在A549細(xì)胞系中沉默PEDF時(shí)，VEGF的表達(dá)以及其下游SRC/FAK通路蛋白的磷酸化水平得到一定程度的促進(jìn)。見圖1。

圖1 PEDF調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)及其下游通路蛋白的表達(dá)Fig.1PEDF regulates the expression of VEGF and downstream pathway proteins

2.2 PEDF影響肺癌細(xì)胞的增殖

PEDF過表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖，PEDF受到抑制后可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖。見圖2。

2.3 PEDF調(diào)節(jié)增殖和凋亡相關(guān)蛋白

圖2 PEDF抑制A549的增殖（n=3）Fig.2Inhibition of A549 proliferation by PEDF（n=3）

圖3 PEDF調(diào)節(jié)蛋白情況Fig.3PEDF regulation of proteins

PEDF過表達(dá)后可以抑制cyclin D1的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)caspase 3的表達(dá)。反之亦然。見圖3。

2.4 PEDF影響肺癌細(xì)胞的遷移

PEDF過表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞A549的遷移，PEDF受到抑制后可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的遷移。見圖4、5。

2.5 PEDF抑制paxillin

PEDF過表達(dá)后可以抑制paxillin的表達(dá)，反之亦然。見圖6。

圖4 PEDF過表達(dá)后可以抑制A549細(xì)胞的遷移×200Fig.4Overexpression of PEDF leads to inhibition of migration of A549 cells×200

圖5 PEDF抑制后可以促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移×200Fig.5Silencing of PEDF expression promotes the migration of A549 cells×200

圖6 PEDF影響paxillin蛋白Fig.6Effect of PEDF on paxillin

3 討論

目前，肺癌是危害人們生命健康的最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率一直居惡性腫瘤發(fā)病率的首席。目前的研究［6-7］表明，肺癌的死亡率約占成人惡性腫瘤死亡數(shù)的25%以上。

PEDF具有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制主要表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤新生血管生成等。PEDF在多種腫瘤中被報(bào)道具有低表達(dá)的現(xiàn)象，但是在非小細(xì)胞肺癌中PEDF的研究較少。VEGF除了調(diào)節(jié)血管生成也可以調(diào)節(jié)下游的SRC/FAK通路，VEGF通過調(diào)節(jié)SRC的磷酸化來激活下游通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游一系列功能蛋白，起到促進(jìn)細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)功能，這一系列生物學(xué)功能都對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用［8］。PEDF可以對VEGF有很強(qiáng)的抑制作用，在機(jī)體發(fā)生惡性腫瘤時(shí)這兩種因子之間的平衡可能會向著有利于血管形成的方向發(fā)展［9-10］。PEDF在影響VEGF來抑制血管生成之余，是否可以通過抑制VEGF來抑制其下游通路進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的一系列生物學(xué)功能，成為研究的重點(diǎn)。

本研究通過在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中過表達(dá)或沉默PEDF，檢測了VEGF及其下游SRC/FAK通路蛋白磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)PEDF可以通過抑制VEGF的表達(dá)來抑制SRC與FAK的磷酸化水平，也就是說PEDF可以抑制VEGF/SRC/FAK通路的活性。接下來通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在A549細(xì)胞中PEDF具有抑制細(xì)胞生長的作用，PEDF對細(xì)胞生長的抑制作用是通過抑制VEGF/SRC/FAK通路下游增殖相關(guān)蛋白cyclin D1與促進(jìn)VEGF/SRC/FAK通路下游凋亡相關(guān)蛋白caspase3的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。Transwell實(shí)驗(yàn)也顯示PEDF可以對A549細(xì)胞的遷移功能具備一定的抑制作用，這一抑制作用是通過抑制VEGF/SRC/FAK通路下游paxillin蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了PEDF在非小細(xì)胞肺癌組織中可以通過抑制VEGF的表達(dá)來抑制VEGF/SRC/FAK通路進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能?？赡転榉切〖?xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)。

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（編輯 于溪）

PEDF Inhibits Non-small Cell Lung Cancer Proliferation by Down-regulating VEGF Expression

ZHOU Lixia，WU Yueming，LI Na
（Department of Oncology，The Third Affiliated Hospital，Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China）

ObjectiveTo analyze the mechanism of pigment epithelium-derived factor（PEDF）regulation in lung cancer cell proliferation and migration by vascular endothelial growth factor（VEGF）.MethodsVEGF expression was observed after overexpression or silencing of PEDF. Proliferation and migration were analyzed by MTT and transwell assays.Real-time PCR and Western blotting were performed to investigate the mechanism underlying PEDF regulation of the VEGF/SRC/FAK pathways.ResultsPEDF could inhibit the proliferation and migration of A549 cells by VEGF.ConclusionPEDF can be considered as a potential therapeutic target for lung cancer.

non-small lung cancer；VEGF；A549；PEDF

R734.2

A

0258-4646（2017）05-0422-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.010

遼寧省自然科學(xué)基金（2015020366）

周立霞（1981-），女，主治醫(yī)師，博士研究生.通信作者：吳明月，E-mail：ymwu67@sina.com

2016-07-06

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