趙美瞇，李卓，楊艷，張翀翯，陳思充，曾曉榮，郝麗英

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110122；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川瀘州646000）

注射異丙腎上腺素建立大鼠心肌肥厚模型

趙美瞇1，李卓1，楊艷2，張翀翯1，陳思充1，曾曉榮2，郝麗英1

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽(yáng)110122；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川瀘州646000）

目的采用異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚，建立大鼠模型，并研究該動(dòng)物模型的基本特性。方法大鼠背部皮下注射劑量為5 mg/kg的異丙腎上腺素，每日1次，連續(xù)注射14 d。結(jié)果模型組大鼠的全心重/體質(zhì)量，左心室重/體質(zhì)量均明顯增加。模型組大鼠血清中羥脯氨酸（HYP）含量顯著增加。模型組大鼠心肌組織中總超氧化物歧化酶（SOD）含量與對(duì)照組相比顯著降低，而丙二醛（MDA）含量明顯升高。結(jié)論皮下注射異丙腎上腺素14 d，可成功誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚模型，為深入研究心肌肥厚的確切機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

心肌肥厚；異丙腎上腺素；動(dòng)物模型

異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）是β受體激動(dòng)劑，通過(guò)激活動(dòng)物腎上腺素促進(jìn)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激心肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)DNA的合成以及蛋白的表達(dá)，引起膠原沉積、心肌纖維化，最終出現(xiàn)心肌肥厚［1-2］。目前，注射ISO建立心肌肥厚動(dòng)物模型的方法雖然很常用，但是其藥物劑量和給藥時(shí)間并不統(tǒng)一。本研究根據(jù)文獻(xiàn)資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，擬選擇大鼠皮下注射ISO建立心肌肥厚模型，模擬心肌肥厚的實(shí)際病理生理過(guò)程，為后續(xù)研究心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制和治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，雌性、雄性各12只，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。

1.1.2 主要藥品與試劑盒：ISO購(gòu)自TCI公司，貨號(hào)為I0260。肌酸激酶（creatine kinase，CK）試劑盒，羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）試劑盒，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒，以及丙二醛（malondialdehvde，MDA）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，貨號(hào)分別為A032，A030-2，A001-1，A003-1。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心肌肥厚造模：將24只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組，每組12只，雌雄各半。2組大鼠背部分別皮下注射0.9%NaCl和ISO，劑量為5 mg/kg，每日1次，連續(xù)注射14 d，自由進(jìn)食水。ISO配制成2.5mg/mL的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。注射劑量為0.2mL/100 g體質(zhì)量［8］。

1.2.2 心肌肥厚模型的指標(biāo)檢測(cè)：造模第15天，大鼠稱重后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥位固定。首先，開(kāi)腹進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血。具體操作為打開(kāi)腹腔，用鑷子將腹腔臟器翻轉(zhuǎn)一側(cè)后，撥開(kāi)脊柱前脂肪和筋膜，暴露腹主動(dòng)脈；采血針穿刺腹主動(dòng)脈見(jiàn)回血后，另一端插入BD真空管，取大約5 mL全血，室溫靜置。3 000 r/min，10 min，4℃離心后，取上層血清大鼠放入2 mL EP管中，用于CK與HYP測(cè)定。然后打開(kāi)胸腔，暴露心臟，剪開(kāi)肺動(dòng)脈放心腔內(nèi)血，用0.9%NaCl從主動(dòng)脈沖洗心臟之后，將心臟完整取下。將心臟洗凈后肉眼觀察心臟大小，并拍照，稱重。計(jì)算心肌肥厚指數(shù)，包括全心重（mg）/體質(zhì)量（g）（heart weight/body weight，HW/BW）和左心室重（mg）/體質(zhì)量（g）（left ventricular weight/body weight，LHW/BW）。取左心室上部浸泡于4%多聚甲醛溶液中保存，用于組織切片HE染色。取左心室中部，-80℃保存，用于制成心肌組織勻漿，進(jìn)行SOD與MDA的測(cè)定。

CK、HYP、SOD和MDA的檢測(cè)按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠的體質(zhì)量和心肌肥厚指數(shù)水平

連續(xù)注射ISO 14 d后，與雌性、雄性對(duì)照組分別比較，模型組大鼠的HW/BW分別為（5.65±0.23）mg/g和（4.68±0.06）mg/g（P＜0.01），LHW/BW分別為4.05±0.15和3.44±0.08（P＜0.01），均明顯增加，見(jiàn)表1。其中，雌性和雄性模型組大鼠HW/BW分別是對(duì)照組的1.65倍和1.45倍，LVW/BW分別是對(duì)照的1.56倍和1.45倍。雌性模型組大鼠心臟增加的倍數(shù)與雄性組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示ISO誘導(dǎo)心肌肥厚在雌性和雄性SD大鼠均可造模成功。

2.2 模型大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

連續(xù)注射ISO 14 d后，模型組大鼠心臟體積明顯增大。HE切片染色顯示對(duì)照組心肌細(xì)胞正常，細(xì)胞之間排列整齊；模型組心肌纖維粗大紊亂，心肌細(xì)胞橫斷面的直徑增大，細(xì)胞核變形，間質(zhì)增寬，出現(xiàn)纖維化，偶見(jiàn)淤血，見(jiàn)圖1。

表1 模型大鼠的體質(zhì)量和心肌肥厚指數(shù)水平Tab.1Body weight and cardiac hypertrophy index in model rats

2.3 模型大鼠的血清中CK和HYP水平

ISO誘導(dǎo)的模型組大鼠的血清中CK活力，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2A）。模型組和對(duì)照組大鼠的血清中HYP含量分別為（22.22±0.64）μg/mL和（19.77±0.59）μg/mL，模型組含量明顯增加（P＜0.05，圖2B）。

2.4 模型大鼠的心肌組織中SOD和MDA含量

模型組大鼠的心肌組織中SOD活力為（111.25± 2.91）U/mg，對(duì)照組SOD活力為（170.32±21.05）U/ mg，模型組明顯降低（P＜0.05，圖3A）。大鼠心肌組織中模型組（n=3）和對(duì)照組（n=3）MDA含量分別為（0.87±0.03）mol/mg和（0.47±0.09）mol/mg，模型組有明顯增加（P＜0.05，圖3B）。

3 討論

心肌肥厚早期因心室壁增厚、心肌收縮力增強(qiáng)而被視為代償性過(guò)程，但是在病理性刺激長(zhǎng)久持續(xù)的情況下，心肌肥厚伴隨心肌纖維化的發(fā)生，心肌收縮功能失調(diào)，能量代謝異常，電生理功能紊亂，最終出現(xiàn)失代償性的心力衰竭［3-5］。本研究采用ISO誘發(fā)的心肌肥厚模型很好地模擬了這一失代償過(guò)程，觀察到心臟體積的增大、心肌細(xì)胞的肥大、心肌組織的纖維化和氧化代謝異常等。

圖1 心肌肥厚模型大鼠的心肌組織HE染色×40Fig.1Hematoxylin-eosin staining of myocardial tissue in rats with myocardial hypertrophy×40

圖2 心肌肥厚模型大鼠的血清中CK和HYP水平Fig.2Serum CK and HYP levels in rats with myocardial hypertrophy

圖3 心肌肥厚模型大鼠的心肌組織中SOD和MDA含量Fig.3Levels of SOD and MDA in rats with myocardial hypertrophy

HYP在氧化劑的作用下，二甲氨基苯甲醛與HYP產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物作用出現(xiàn)紫紅色，根據(jù)紫紅色的深淺利用比色法可計(jì)算出HYP的含量。結(jié)果顯示模型組大鼠的血清HYP含量顯著增加。心肌纖維化時(shí)，主要增加的成分是膠原纖維，HYP為膠原纖維所特有［6］，因此，模型大鼠HYP的增加提示該模型大鼠心肌肥厚時(shí)，間質(zhì)纖維增生，心臟纖維化。SOD在體內(nèi)氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡中有很重要的作用，超氧陰離子自由基可被此酶消除，防止細(xì)胞受到損傷。超氧陰離子自由基是在黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生的，它可氧化羥胺生成亞硝酸鹽，并在顯色劑的作用下出現(xiàn)紫紅色，可測(cè)出其吸光度。若被測(cè)樣品中存在SOD時(shí)，可專一性抑制超氧陰離子自由基，使亞硝酸鹽的生成減少，此時(shí)測(cè)得的測(cè)定管吸光度值比對(duì)照管的吸光度值低，SOD活力即可通過(guò)公示算出。MDA是過(guò)氧化脂質(zhì)降解的產(chǎn)物，硫代巴比妥酸可與其反應(yīng)，隨即生成紅色產(chǎn)物，利用比色法可推算出MDA含量。模型組心肌組織中總SOD含量降低、MDA含量的明顯增加，反映了心肌細(xì)胞清除氧自由基的能力有所下降，受自由基攻擊的嚴(yán)重程度升高，脂質(zhì)過(guò)氧化程度加重，心肌損傷［7］。

以上研究結(jié)果證實(shí)，大鼠背部皮下注射ISO（5 mg/kg）2周，成功達(dá)到心肌肥厚的指標(biāo)。心肌組織的纖維化和氧化代謝異常與鈣離子信號(hào)通路密切相關(guān)，將設(shè)計(jì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)利用該動(dòng)物模型深入研究鈣離子信號(hào)通路在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，擬從新的視角探討心肌肥厚的作用機(jī)理。此外，該模型簡(jiǎn)單易行，重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)可靠，也適合于開(kāi)展新藥的藥效學(xué)研究。

［1］CHOWDHURY D，TANGUTUR AD，KHATUA TN，et al.A proteomic view of isoproterenol induced cardiac hypertrophy：prohibitin identified as a potential biomarker in rats［J］.J Transl Med， 2013，11：130.DOI：10.1186/1479-5876-11-130.

［2］WANG JJ，RAU C，AVETISYAN R，et al.Genetic dissection of cardiac remodeling in an isoproterenol-induced heart failure mouse model［J］.PLoS Genet，2016，12（7）：e1006038.DOI：10.1371/ journal.pgen.1006038.

［3］SHIMIZU I，MINAMINO T.Physiological and pathological cardiac hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，2016，97：245-262.DOI：10.1016/j.yjmcc.2016.06.001.

［4］THAM YK，BERNARDO BC，OOI JY，et al.Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure：signaling pathways and novel therapeutic targets［J］.Arch Toxicol，2015，89（9）：1401-1438. DOI：10.1007/s00204-015-1477-x.

［5］PAPAIT R，CATTANEO P，KUNDERFRANCO P，et al.Genomewide analysis of histone marks identifying an epigenetic signature of promoters and enhancers underlying cardiac hypertrophy［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（50）：20164-20169.DOI：10.1073/ pnas.1315155110.

［6］ENGEBRETSEN KV，SKA°RDAL K，BJΦRNSTAD S，et al.Attenuated development of cardiac fibrosis in left ventricular pressure overload by SM16，an orally active inhibitor of ALK5［J］.J Mol Cell Cardiol，2014，76：148-157.DOI：10.1016/j.yjmcc.2014.08.008.

［7］JI XX，SONG XL，QIAN W，et al.Effects and mechanism of action of ligustrazine on isoprenaline-induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Cell Biochem Biophys，2014，70（3）：1513-1518.DOI：10. 1007/s12013-014-0086-2.

（編輯 于溪）

Rat Model of Isoproterenol-induced Cardiac Hypertrophy

ZHAO Meimi1，LI Zhuo1，YANG Yan2，ZHANG Chonghe1，CHEN Sichong1，ZENG Xiaorong2，HAO Liying1
（1.Department of Drug Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang，110122，China；2.Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education，Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease，Institute of Cardiovascular Research，Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

ObjectiveTo establish a rat model of cardiac hypertrophy induced by isoproterenol（ISO），and to study its basic characteristics.MethodsCardiac hypertrophy was induced in rats with ISO.The model rats received subcutaneous injections of 5 mg/kg ISO every day for 14 days.ResultsThe heart weight/body weight and left ventricular weight/body weight ratios in model rats were significantly increased.The serum hydroxyproline level was significantly increased，the superoxide dismutase level was significantly decreased，and the malondialdehyde level was significantly increased in model rats.ConclusionThe rat model of cardiac hypertrophy is successfully created by subcutaneous injection of ISO for 14 days.This model can be used in study of the mechanism of cardiac hypertrophy.

cardiac hypertrophy；isoproterenol；animal model

R96

A

0258-4646（2017）05-0406-03

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.006

國(guó)家自然科學(xué)基金（31500930，31471091）；醫(yī)學(xué)電生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（KeyME-2014-03）

趙美瞇（1978-），女，講師，博士.

曾曉榮，E-mail：zengxiaorong8818@163.com

2016-08-31

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：