蘇敬陽，邵冬雪，雷明，康澤，趙君，方涵田，郭鳳，趙美瞇，郝麗英，封瑞

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽110122）

心肌Cav1.2鈣通道NT片段的提取純化及其與CaM的相互作用

蘇敬陽，邵冬雪，雷明，康澤，趙君，方涵田，郭鳳，趙美瞇，郝麗英，封瑞

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽110122）

目的探討心肌Cav1.2鈣通道NT蛋白片段提取與純化的方法，并研究其與CaM的相互作用。方法將NT的cDNA插入pGEX-6p-3質(zhì)粒載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21感受態(tài)細(xì)胞，大量培養(yǎng)并利用異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)NT的GST融合蛋白表達(dá)，GS-4B beads分離純化，PreScission蛋白酶切除GST標(biāo)簽，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDSPAGE）檢測(cè)蛋白純度和相對(duì)分子質(zhì)量。采用GST pull-down實(shí)驗(yàn)研究NT片段與CaM的相互作用。結(jié)果SDS-PAGE結(jié)果顯示成功純化獲得NT蛋白片段，且具有較高的純度。GST pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NT可與CaM結(jié)合，且具有濃度依賴性。結(jié)論本研究成功制備與純化了心肌Cav1.2鈣通道NT蛋白片段，為深入研究蛋白相互作用及NT的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

NT；提?。患兓?；CaM；GST pull-down實(shí)驗(yàn)

L型電壓門控鈣離子通道控制細(xì)胞鈣離子（Ca2+）對(duì)膜電位變化的反應(yīng)，并在心肌動(dòng)作電位的產(chǎn)生、興奮收縮偶聯(lián)、激素和神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、釋放等過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［1-5］。其中Cav1.2鈣通道在心肌中高表達(dá)，是Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑，其C末端近端的PreIQ和IQ基序是公認(rèn)的CaM結(jié)合位點(diǎn)，與CaM的相互結(jié)合在鈣依賴性易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和鈣依賴性失活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）調(diào)節(jié)過程中有顯著作用［6-8］。然而，除了C末端的CaM結(jié)合區(qū)域外，還包括N末端的結(jié)合區(qū)域。據(jù)報(bào)道［9］，L型鈣通道N末端的色氨酸殘基（心肌中W82位點(diǎn)，神經(jīng)元中W52位點(diǎn)）是CaM的結(jié)合位點(diǎn)，參與鈣通道CDI的發(fā)生，這個(gè)結(jié)合區(qū)域被命名為NSCaTE（N-terminal spatial Ca2+transforming element）。研究發(fā)現(xiàn)，Cav1.2鈣通道N末端包含蛋白激酶的結(jié)合位點(diǎn)，這表明與鈣通道C末端相同，CaM與蛋白激酶的作用靶點(diǎn)鄰近?？梢姡募av1.2鈣通道NT對(duì)機(jī)體調(diào)節(jié)有重要作用和研究意義。

本研究探討了心肌Cav1.2鈣通道NT蛋白片段提取與純化的方法，并利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)研究了其與CaM的相互作用，為深入研究蛋白相互作用及NT的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6p-3/CaM質(zhì)粒由日本鹿兒島大學(xué)KAMEYAMA教授惠贈(zèng)；pGEX-6p-3/NT質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司合成及提供；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐西林（ampicillin，Amp）、溶菌酶（lysozyme，LYS）、N-十二烷基肌氨酸鈉（N-laurylsarcosine，N-Lau）、TritonX-100均購自Sigma公司；Glutathione-Sepharose 4B beads（GS-4B beads）、PreScission Protease，購自英國GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 GST-NT融合蛋白的誘導(dǎo)及表達(dá)：將重組質(zhì)粒pGEX-6P-3/NT轉(zhuǎn)化入E.coliBL-21感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃水浴、100 r/min振蕩過夜。當(dāng)OD600在0.6～1.0范圍內(nèi)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃水浴、110 r/min振蕩4 h誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。

1.2.2 NT蛋白的提取純化：誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白4 h后，將菌液4 000 r/min離心10 min，棄掉上清收集沉淀。將沉淀用磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）重懸（20 mL PBS/400 mL菌液），加入20 mg/mL溶菌酶LYS和1 mol/L DTT各200 μL，15%的N-Lau 2 mL，混勻后冰上放置30 min。用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理20 min，超聲3 s停7 s，6℃。后加入30%TritonX-100 667 μL，冰上放置30 min。15 000 r/min離心10 min，取上清置于15 mL EP管中，與PBS洗過的GS-4B beads在4℃冰箱內(nèi)孵育搖晃過夜。第2日清晨800 r/min離心棄上清，beads用5 mL Tris buffer洗4次，然后轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，加495 μL Tris buffer、5 μL PreScission蛋白酶，室溫旋轉(zhuǎn)5 h。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，Bradford法測(cè)蛋白濃度。

1.2.3 NT蛋白純度的鑒定：分別將超聲后NT菌液、酶切之前的GST-NT融合蛋白、酶切后的沉淀beads和上清NT蛋白，經(jīng)5×loading緩沖液室溫處理后，煮沸5 min，進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳確認(rèn)，考馬斯亮藍(lán)染色，根據(jù)蛋白條帶位置比對(duì)marker條帶位置檢測(cè)純化的NT相對(duì)分子量和純度。

1.2.4 CaM的分離純化：CaM蛋白的分離純化參照本實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法［10］。

1.2.5 GST pull-down實(shí)驗(yàn)觀察NT與CaM的相互作用：取連接于GS-4B beads的GST-NT蛋白40 μL于2 mL EP管中，加入CaM（終濃度分別為0.35，0.7，1.4，2.1，3.5，7.0，10.0 μmol/L），0.1 mol/L CaCl26 μL（［Ca2+］2 mmol/L），Tris Buffer（pH 8.0）補(bǔ)齊到300 μL的體系。4℃，孵育4 h。800 r/min，離心3 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，離心棄上清，同樣步驟用Tris Buffer（pH 8.0）清洗beads 2遍，最后一遍吸凈上清。加入15 μL 5×SDS loading buffer洗脫處理，煮沸5 min，上清經(jīng)15%SDS-PAGE電泳確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 NT蛋白的提取與純化

本研究采用超聲破碎法獲得GST-NT融合蛋白，此融合蛋白經(jīng)PreScission蛋白酶酶切后，得到高純度的NT蛋白。將超聲后的菌液、GST-NT融合蛋白以及經(jīng)PreScission蛋白酶酶切之后的沉淀beads、上清分別進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，在表觀分子量約為40 000（GST-NT）、26 000（GST）和14 000（NT）處出現(xiàn)蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。表明經(jīng)PreScission蛋白酶酶切后，上清中獲得純度較高的NT蛋白，而沉淀中主要為GST蛋白。說明PreScission蛋白酶能夠切掉GST-NT蛋白上的GST標(biāo)簽，得到純度較高的NT蛋白片段。見圖1。

2.2 GST-NT與CaM相互作用

提取與純化得到的GST-NT蛋白與CaM進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)，在2 mmol/L［Ca2+］條件下，GST-NT與不同濃度的CaM蛋白孵育，然后進(jìn)行15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、灰度值分析后，CaM可與GST-NT結(jié)合，隨著反應(yīng)體系中的CaM濃度的增加，結(jié)合到GST-NT上的CaM也逐漸增加，呈濃度依賴性，表明GST-NT具有與CaM結(jié)合的能力。見圖2。

3 討論

圖1 PreScission蛋白酶酶切NT蛋白Fig.1Purification of the NT peptide after cleavage with PreScission protease to remove the GST tag

心肌Cav1.2鈣通道調(diào)節(jié)控制細(xì)胞內(nèi)很多重要的反應(yīng)，CaM是調(diào)節(jié)Cav1.2鈣通道活性過程中的鈣感受器［9，11］，CaM可與鈣通道C末端IQ區(qū)域、PreIQ區(qū)域、Ⅰ-Ⅱ環(huán)以及N末端等區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)鈣通道的CDF和CDI。近年來，鈣通道C末端IQ區(qū)域和PreIQ區(qū)域與CaM的結(jié)合作用以及可能的生理與病理學(xué)意義得到了廣泛的研究，而N末端的研究相對(duì)較少，因此，提取純化NT蛋白片段對(duì)探尋心肌Cav1.2鈣通道的相關(guān)生物學(xué)功能具有重要的意義。前期研究證實(shí)CaM與Cav1.2鈣通道的結(jié)合具有濃度依賴性和Ca2+依賴性。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，某些合成短肽或多肽片段只能結(jié)合一個(gè)CaM蛋白分子，這表明在很多大的蛋白分子中僅有一個(gè)CaM結(jié)合位點(diǎn)。然而在Cav1.2通道的C末端的IQ和PreIQ區(qū)域存在多個(gè)CaM結(jié)合位點(diǎn)［7-8］，可結(jié)合多個(gè)CaM蛋白分子［13］。不僅如此，研究［9，14］發(fā)現(xiàn)，除了Cav1.2鈣通道C末端外，N末端也可能存在CaM結(jié)合位點(diǎn)，且應(yīng)具有更重要的功能意義。本研究進(jìn)一步證實(shí)了在［Ca2+］為2 mmol/L條件下，CaM與NT蛋白片段存在濃度依賴性的結(jié)合作用，推測(cè)這種結(jié)合作用在維持鈣通道功能方面起到關(guān)鍵作用，然而更為詳細(xì)的結(jié)合模式需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

圖2 CaM與GST-NT結(jié)合的濃度依賴性Fig.2Concentration-dependent binding of CaM to GST-NT

本研究中采用超聲破碎法獲得GST-NT重組蛋白，應(yīng)用PreScission蛋白酶酶切GST標(biāo)簽，酶切效率高，GST標(biāo)簽幾乎全部被切下，提取純化出的單純NT蛋白片段的純度較高。而其他通道蛋白如CT1片段用此法則不能夠制備出，單純應(yīng)用PreScission蛋白酶雖然能夠提取純化出CT3蛋白片段，但濃度低，需要加DTT才能獲得高濃度蛋白片段。因此，NT蛋白片段的提取純化相對(duì)簡(jiǎn)單易操作，效率高。目前，在提取純化NT蛋白片段的研究中，尚未采用B-per試劑盒、變性再復(fù)性、聯(lián)合應(yīng)用DTT等方法，也并未對(duì)NT蛋白片段與CaM突變體的結(jié)合作進(jìn)一步研究，這些有待于在今后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，本研究成功提取純化了NT蛋白片段，同時(shí)鑒定了NT蛋白片段的純度和相對(duì)分子質(zhì)量，利用GST pull-down實(shí)驗(yàn)方法完成了其與CaM的相互作用，為深入研究NT與其他蛋白的相互作用及其生物學(xué)意義奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（編輯 于溪）

Expression and Purification of an N-terminal Fragment of the Cav1.2 Calcium Channel and Characterization of Its Interaction with Calmodulin

SU Jingyang，SHAO Dongxue，LEI Ming，KANG Ze，ZHAO Jun，F(xiàn)ANG Hantian，GUO Feng，ZHAO Meimi，HAO Liying，F(xiàn)ENG Rui
（Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo investigate a method for the purification of the N-terminal peptide fragment（NT）of the myocardial calcium channel Cav1.2，and characterize its interaction with calmodulin（CaM）.MethodsEscherichia coliBL-21 cells were transformed with plasmid pGEX-6p -3/NTharboringtheNT-GSTfusiongene.ThecellsharboringpGEX-6p-3/NTwereculturedandproteinexpressionwasinducedwithisopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）.Then，the GST-NT fusion protein was purified by using glutathione Sepharose 4B（GS-4B）beads.GST was cleaved off with the PreScission protease，and SDS-PAGE was performed to detect the purity and relative molecular weight of the purified peptide.Further，GST pull-down assay was performed to characterize the interaction of the NT peptide with CaM.ResultsSDS-PAGE analysis showed that the NT peptide was successfully purified，with high purity.Results of the GST pull-down assay showed that the NT peptide could interact with CaM.ConclusionThis study establishes a method for the purification of the NT peptide and lays the foundation for further research on the interaction partners and biological functions of NT.

NT；extraction；purification；CaM；GST pull-down assay

R96

A

0258-4646（2017）05-0397-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.004

國家自然科學(xué)基金（31400981，31471091）；大學(xué)生創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2015069，201510159068，201510159047，2016101 59000064）

蘇敬陽（1992-），女，碩士研究生.

封瑞，E-mail：fengrui527@163.com

2016-11-10

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