趙彥楠，劉洪祥，霍佳寧，馬曉欣

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

晚期糖基化終末產(chǎn)物在多囊卵巢綜合征大鼠模型中的表達

趙彥楠，劉洪祥，霍佳寧，馬曉欣

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽110004）

目的研究晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）在脫氫表雄酮（DHEA）誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠模型中的表達。方法采用DHEA造模法建立PCOS大鼠模型。造模成功后，選用競爭性ELISA法檢測血清AGEs表達水平，免疫組織化學(xué)法檢測大鼠模型卵巢組織中AGEs的表達。結(jié)果實驗組大鼠血清AGEs水平明顯高于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，AGEs在實驗組卵巢組織中呈高表達（P＜0.01）。結(jié)論AGEs在PCOS大鼠模型中高表達，在PCOS診斷和發(fā)病機制的研究中均具有重要的參考價值。

多囊卵巢綜合征；晚期糖基化終產(chǎn)物；大鼠

多囊卵巢綜合征（polycystic covarian syndrome，PCOS）是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，以持續(xù)性無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣鞯木C合癥候群。胰島素抵抗、糖代謝異常是PCOS的核心病理機制［1］，兩者也同樣存在于其遠期并發(fā)癥（2型糖尿病、心血管疾病）［2］。有研究［3］表明，糖尿病患者血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）含量要遠遠高于正常人，并且在高血糖的形成中起到了重要的作用。AGEs是在持續(xù)高糖狀態(tài)下，還原糖的游離醛基，在非酶促條件下與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)的自由氨基經(jīng)過脫水、縮合、裂解、環(huán)化、氧化修飾后形成的穩(wěn)定的終末產(chǎn)物。AGEs與其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）相互作用能夠促進系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，造成細胞毒性和細胞損傷，進而引起一系列疾病［4-5］。研究［6］表明，AGEs與一些代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PCOS是一種代謝障礙性全身性疾?。?］，目前AGEs對它的影響還知之甚少。本課題組前期研究［8］發(fā)現(xiàn)，脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）聯(lián)合高脂飲食法制作PCOS大鼠模型出現(xiàn)的卵巢病理改變及激素水平改變等典型內(nèi)分泌變化與PCOS患者相似，是一種較為理想的PCOS動物模型。本研究通過建立PCOS大鼠模型，檢測AGEs在PCOS大鼠模型中的表達，并探討其對PCOS的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

選取40只21日齡雌性Sprague-Dawly（SD）大鼠，體質(zhì)量200～250 g，均購自中國醫(yī)科大學(xué)本溪實驗動物中心。AGE-ELISA試劑盒購自美國Cloud-Clonecorp公司。兔多克隆抗體AGE購自美國Abcam公司。免疫組化SP試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型建立：采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機分為實驗組（n=20）和對照組（n=20）。每只大鼠均飼以高脂顆粒飼料，自由飲水，室溫（22.0±3.0）℃，照明采用晝夜亮暗周期循環(huán)。將DHEA（60 mg/kg）溶于0.2 mL注射油劑中，實驗組大鼠每日頸背部皮下注射DHEA+注射油劑0.2 mL，連續(xù)20 d；對照組大鼠每日頸背部皮下注射0.2 mL注射油劑，連續(xù)20 d。

1.2.2 標(biāo)本采集：造模成功后行腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血（約5 mL），分離血清，-80°C凍存?zhèn)溆?。分離摘取雙側(cè)卵巢，經(jīng)修剪多余組織及脂肪組織后，雙側(cè)卵巢置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片待測。

1.2.3 血清中AGEs測定：ELISA法檢測血清中AGEs水平。操作步驟按說明書進行，450 nm波長酶標(biāo)儀進行檢測。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測：采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin peroxidase，SP）法進行AGEs免疫組化染色，一抗?jié)舛认♂尀?∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照。陽性結(jié)果判斷，光學(xué)顯微鏡下觀察為棕黃色顆粒即AGEs表達陽性。高倍鏡下每例隨機選取5個不重疊的視野，估計陽性細胞百分數(shù)后取均值。按陽性細胞百分數(shù)評分，＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；按染色強度評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；兩項相乘后取平均值，0～4分為陰性表達，＞4分為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.12 組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)比較

光學(xué)顯微鏡下卵巢HE染色可見對照組卵巢形態(tài)正常，卵泡發(fā)育正常，皮質(zhì)可見不同發(fā)育階段的卵泡及黃體。實驗組鏡下可見較多閉鎖卵泡及囊性擴張性卵泡且多集中在卵巢邊緣，卵泡內(nèi)顆粒細胞層數(shù)明顯減少甚至消失，卵巢呈典型的多囊樣變。符合多囊卵巢病理改變。見圖1。

圖12 組大鼠卵巢組織HE染色切片×4Fig.1HE staining of ovariany tissue in the control group and experimental groups×4

2.22 組血清中AGEs水平比較

結(jié)果顯示，實驗組血清中AGEs含量低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 AGEs在PCOS大鼠模型卵巢中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，對照組卵巢顆粒細胞及卵泡膜細胞染色強度減弱，甚至未見染色（圖2A）。在實驗組中卵巢顆粒細胞的胞質(zhì)及部分卵泡膜細胞可見棕褐色顆粒，呈明顯的陽性表達，陽性表達率為70%（圖2B）。半定量分析結(jié)果顯示，與對照組相比，AGEs在實驗組卵巢組織中呈高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.101，P＜0.01），見表1。

表1 對照組及實驗組血清及卵巢中AGEs表達Tab.1Expression of AGEs in the ovarian tissues of the control and experimental groups

3 討論

近年來的研究［9］發(fā)現(xiàn)，AGEs在多種代謝性疾?。ㄈ绶逝?、糖尿病等）中起重要作用。AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合激活多種下游信號通路，如細胞核因子κB（nuclear factor kappa B，NK-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等，進而導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激及促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生［10-11］。AGEs引起氧化應(yīng)激的形成，進一步的氧化應(yīng)激刺激更多的AGEs合成，致使機體長時間處于一種慢性低度炎癥狀態(tài)［12-13］。多位國內(nèi)外研究學(xué)者［14］證實，PCOS患者體內(nèi)C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）等多種炎性細胞因子水平升高，進而引發(fā)多種病理狀態(tài)，還可能與胰島素抵抗及高雄激素血癥有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組AGEs濃度明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示AGEs可能與PCOS的發(fā)生密切相關(guān)，這為PCOS的診斷以及發(fā)病機制研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

在人卵巢顆粒細胞系模型中，AGEs通過干擾顆粒細胞中促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）行為激活細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（external signal regulated kinases/mitogen activated protein kinase，ERK1/ 2MAPKs）通路從而引起異常卵泡發(fā)育，導(dǎo)致卵巢功能障礙［15］。在卵泡發(fā)育過程中，卵母細胞由于自身難以合成葡萄糖，能量大部分來源于顆粒細胞糖酵解［16］。AGEs可能通過減少顆粒細胞膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLU-4）受體數(shù)量降低葡萄糖攝入從而影響卵母細胞生長［17］。另外，TATONE等［18］研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞內(nèi)累積的AGEs還能夠干擾細胞內(nèi)線粒體功能、誘導(dǎo)細胞凋亡以及造成DNA損傷。本實驗利用免疫組化的方法檢測AGEs在實驗組卵巢組織與對照組卵巢組織中的蛋白表達，證實AGEs在實驗組卵巢中的表達遠遠高于對照組。并且，AGEs大量分布在卵巢顆粒細胞中，推測AGEs在顆粒細胞中表達增高可能是影響卵母細胞成熟發(fā)育，進而形成大量閉鎖卵泡的重要因素。

綜上所述，AGEs在PCOS大鼠模型血清及卵巢中表達均升高，并且在卵巢顆粒細胞中呈高表達。但AGEs在PCOS中的表達調(diào)控機制尚不完全清楚，有待深入研究。

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（編輯 武玉欣）

Expression of Advanced Glycation End Products in a Rat Model of Polycystic Ovarian Syndrome

ZHAO Yannan，LIU Hongxiang，HUO Jianing，MA Xiaoxin
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expression of advanced glycation end products（AGEs）in a rat model of polycystic ovarian syndrome（PCOS）induced by dehydroepiandrosterone.MethodsThe PCOS rat model was established using dehydroepiandrosterone.After confirming that the model rats were set up successfully，serum AGEs concentrations were measured using competitive ELISA and the expression of AGEs in the ovarian tissues of these rats was detected using immunohistochemistry.ResultsThe serum AGEs level in the experimental group were significantly higher than that in the control group（P＜0.05）.Furthermore，AGEs expression were significantly higher in the experimental group than in the control group（P＜0.01）.ConclusionAGEs are highly expressed in the rat PCOS model，signifying their importance in the diagnosis and pathogenesis of PCOS.

polycystic ovarian syndrome；advanced glycation end products；rat

R711.75

A

0258-4646（2017）05-0388-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.05.002

國家自然科學(xué)基金（81472438，81272874）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2013225079）；沈陽市科學(xué)技術(shù)項目（F14-158-9-47）

趙彥楠，（1993-），女，碩士研究生.

馬曉欣，E-mail：maxiaoxin666@aliyun.com

2017-01-13

網(wǎng)絡(luò)出版時間：