姚懷兵，趙 毅，朱 妍，劉夢麗，劉 宏，任 方，黃 炯

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

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O型口蹄疫病毒不同宿主適應(yīng)毒P1基因分析

姚懷兵1,3，趙 毅2，朱 妍1，劉夢麗1，劉 宏2，任 方2，黃 炯3*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.天康生物股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000；3.新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，新疆烏魯木齊 830000)

為了明確O型口蹄疫病毒不同宿主適應(yīng)毒P1基因變異趨勢，將口蹄疫病毒分別接種于牛、乳鼠、豬及BHK-21細胞，獲得相應(yīng)宿主的適應(yīng)毒，以各宿主適應(yīng)毒RNA為模板，擴增出P1(1A、1B、1C、1D)基因，將各適應(yīng)毒株擴增的P1基因序列相互比對。結(jié)果表明，牛、乳鼠、豬、BHK-21細胞宿主適應(yīng)毒株P(guān)1基因的核苷酸及其編碼的氨基酸序列均未發(fā)生缺失；部分關(guān)鍵性氨基酸發(fā)生了變異，變異發(fā)生在VP1主要抗原區(qū)域的141-160位和200-213位、VP2抗原表位的156-166位和217-220位；VP3抗原蛋白發(fā)生較少氨基酸變異；VP4均未發(fā)生變異。試驗結(jié)果為進一步分析不同宿主適應(yīng)毒基因組的變異關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

O型口蹄疫病毒；不同宿主適應(yīng)毒；P1基因

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬，是無囊膜病毒，其基因組為單股正鏈RNA，全長約有8 500 bp左右[1-2]?；蚪M的中部是一個大的開放閱讀框(ORF)，編碼病毒的多聚蛋白，該聚蛋白經(jīng)一級裂解后形成L前導(dǎo)蛋白、P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白、P2區(qū)和P3區(qū)非結(jié)構(gòu)蛋白。FMDV P1區(qū)結(jié)構(gòu)蛋白最終成熟裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,這4種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成了FMDV衣殼[3-4]。其中，結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3是構(gòu)成病毒衣殼的主要蛋白，也是主要抗原蛋白[5-6]。

已有研究表明，在FMDV抗原結(jié)構(gòu)中VP1～VP4都有其重要作用。衣殼蛋白中VPl能誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，VP2具有抗原性，VP3具有無規(guī)則卷曲的柔性，在物理形態(tài)上表現(xiàn)出可動性和生化上的多功能性，在很大程度上增加了FMDV的抗原性，其還具有多段抗原決定簇，是機體免疫攻擊的對象，在影響病毒衣殼組裝和分解中起重要作用[7-11]。VP4蛋白在不同血清型中高度保守，具有1個主要的T細胞表位，在免疫應(yīng)答中起決定性作用[12-13]。由此可見，P1的研究對掌握FMDV生物學特性和增殖機理,開展免疫學研究,診斷技術(shù)研究,新型疫苗開發(fā)都有著重要作用。

本研究通過緬甸98譜系FMDV在牛、乳鼠、豬、BHK-21細胞4種宿主進行攻毒、傳代，獲得以上宿主適應(yīng)毒，運用分子生物學技術(shù)和生物分析軟件，分析不同宿主適應(yīng)毒P1基因內(nèi)各結(jié)構(gòu)蛋白變異情況，研究FMDV宿主間遺傳變異趨勢，以期對FMDV基因組的結(jié)構(gòu)特征以及口蹄疫在宿主間傳染關(guān)系有新的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MiniBEST viral RNA/DNA Extration Kit Ver 5、Primer ScriptTMRT Reagent kit(Perfect Real Time)、DNA Ligation Kit Ver 2.1、T-Vector pMD19 購自TakaRa公司；PCR Master MixTaq酶購自Thermo公司；DNA純化回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞購自TIANGEN公司；Gibco培養(yǎng)基、100 mL/L胎牛血清購自寶生物工程(大連)有限公司；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELLSA檢測試劑盒購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.1.2 毒株與細胞 O型口蹄疫緬甸98譜系病毒(O/XJ/10-11)由蘭州獸醫(yī)研究所國家參考實驗室分離鑒定，由天康生物股份有限公司保存，作為原始毒種；不同宿主適應(yīng)毒、幼倉鼠腎細胞(BHK-21)均由天康生物股份有限公司提供和保存。

1.1.3 試驗用動物 3日齡～7日齡Balb/c乳鼠購自新疆醫(yī)科大學；2月齡犢牛、40日齡仔豬由天康生物股份有限公司動物房飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 利用生物學軟件Vector NTI 11.5，對O/XJ/10-11毒株的基因序列按P1(1A、1B、1C、1D)基因的順序分段設(shè)計引物(表1)，委托北京博邁德科技發(fā)展有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.2 獲取不同宿主適應(yīng)毒 參照《口蹄疫檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1181—2010)，將O/XJ/10-11株病毒離心后吸取上清，攻毒乳鼠，收集運動不靈活、四肢麻痹、呼吸迫促、30 h左右出現(xiàn)典型口蹄疫癥狀最終死亡的乳鼠，處理尸體，采樣研磨，4 ℃過夜，離心取其上清，保存?zhèn)溆?。牛、豬攻毒前采血，通過ELLSA試劑盒檢測為陰性，挑取健康牛、豬、3日齡～7日齡乳鼠，O型口蹄疫病毒抗體進行攻毒，收取足量的不同宿主適應(yīng)毒。選擇細胞形態(tài)正常，形成良好單層的BHK-21細胞，傾去舊的Gibco培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基洗細胞面兩次，然后接種第1代乳鼠毒，傳代收取BHK-21適應(yīng)毒。豬毒傳至第5代，牛毒傳至第4代，乳鼠傳至第5代，BHK-21傳至第25代，收毒，置-80℃冰箱保存。

1.2.3 病毒RNA的提取 取牛、豬、乳鼠、BHK-21細胞適應(yīng)毒各200 μL原液，按照RNA抽提試劑盒提供的方法提取RNA，所有器皿和試劑均經(jīng)DEPC(焦碳酸二乙酯)去RNA酶處理。

1.2.4 cDNA的制備 按照TaKaRa Primer ScriptTMRT Reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法進行RT-PCR。反轉(zhuǎn)錄50 μL體系如下：5×buffer prime script 10 μL，Prime Script?RT Enzyme Mix 2.5 μL，Oligo dT Primer 2.5 μL，Random 6 mers 2.5 μL，模板為牛、豬、乳鼠、BHK-21細胞適應(yīng)毒的RNA各32.5 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：離心混勻后，在42 ℃水浴40 min～60 min，70 ℃水浴10 min。

1.2.5 陽性DNA克隆、連接和轉(zhuǎn)化 用制備的cDNA為模板進行PCR擴增，其50 μL反應(yīng)體系如下：TaqDNA聚合酶(0.05 U/μLTaqDNA polymerase，reaction buffer，4 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L dNTPs 25 μL，模板5 μL，上游引物(10 pmol/L)2.5 μL，下游引物(10 pmol/L)2.5 μL，無核酸酶純水15 μL。離心混勻后置于PCR自動擴增儀中，擴增條件為：94 ℃ 2 min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 1 min 10 s，30次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后，經(jīng)過10 g/L的瓊脂糖電泳檢測。將擴增出的目的片段用DNA膠純化回收試劑盒純化，將回收的目的DNA連接到pMD19-T載體，連接體系為：純化回收的目的基因4.5 μL，pMD19-T載體0.5 μL，SolutionI 5 μL，混勻后放入連接儀中，連接2 h～3 h。連接反應(yīng)結(jié)束后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞(冰上操作)。37℃、200 r/min搖床孵育，預(yù)培養(yǎng)45 min。均勻涂板于含氨芐西林的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落接種于含有氨芐的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.6 目的基因的核苷酸序列的測定及分析 經(jīng)PCR鑒定為陽性菌后，將陽性菌液保存于150 mL/L的甘油中，送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。用通用引物對P1基因陽性質(zhì)粒測序，得到克隆基因片段的核苷酸序列，用Vector NTI 11.5軟件進行拼接、翻譯，得到4種宿主適應(yīng)毒的P1基因序列。用DNA Star軟件中的Megalign對所得序列與原始序列進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 動物攻毒試驗結(jié)果

將制備的第1代原始毒接種乳鼠，待其發(fā)病后采集病料，連續(xù)傳至第5代。從第4代起，發(fā)病時間穩(wěn)定，毒力變強且比較穩(wěn)定，每0.2 mL病毒含量LD50在108.0～108.5之間。各代次對乳鼠的毒力及LD50測定結(jié)果見表2。將制備的第1 代原始毒接種牛，待其發(fā)病后采集病料，繼續(xù)對牛傳代，傳至第4 代。測定第1 代至第4 代毒對牛的ID50，結(jié)果說明從第 3代起，對牛的毒力變強且比較穩(wěn)定，毒價ID50在106.1/0.2 mL～106.3/0.2 mL之間(表3)。

將制備的第1 代原始毒接種豬，待其發(fā)病后采集病料，繼續(xù)對豬傳代，傳至第5 代。測定第1 代至第5 代毒對豬的ID50，結(jié)果說明從第 3代起，對豬的毒力變強且比較穩(wěn)定，毒價ID50在107.1/0.2 mL～107.2/0.2 mL之間(表4)。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

從牛、豬、乳鼠及BHK-21細胞毒的傳代性FMDV中提取RNA，并用設(shè)計引物對基因1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)進行PT-PCR擴增，經(jīng)電泳檢測，牛、豬、乳鼠及BHK-21細胞的適應(yīng)毒分別在399、683、780、672 bp左右均出現(xiàn)擴增條帶(圖1)，均與預(yù)期目的片段大小相符，且特異性好。

表2 乳鼠的適應(yīng)性傳代及毒力測試

表3 牛的適應(yīng)性傳代及半數(shù)感染量(ID50)的測定

表4 豬的適應(yīng)性傳代及半數(shù)感染量(ID50)的測定

1.陰性對照；2～5.BHK-21細胞毒， 2.1D，672 bp;3.1C，780 bp;4.1B，683 bp;5.1A 339 bp；M.DNA 標準 DL 2 000；6～9.豬毒， 6.1D，672 bp;7.1C，780 bp;8.1B，683 bp;9.1A，339 bp；10～13.乳鼠毒，10.1D，672 bp,11.1C，780 bp,12.1B，683 bp,13.1A 339 bp；14～17.牛毒，14.1D，672 bp,15.1C，780 bp,16.1B，683 bp,17.1A，339 bp

2.3 菌液的PCR鑒定結(jié)果

連接轉(zhuǎn)化后獲得的白色菌落，挑取單菌落進行培養(yǎng)，用1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)特異性的引物分別對挑取的菌液進行PCR擴增，經(jīng)電泳檢測，牛、豬、乳鼠及BHK-21細胞適應(yīng)毒的菌液均獲得與預(yù)期條帶大小為399 bp、683 bp、780 bp、672 bp左右的片段(圖2)。不同適應(yīng)毒的1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1)基因已插入pMD19-T載體。

2.4 不同宿主間的P1基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列分析

對不同宿主分別連續(xù)傳代后，獲得不同宿主適應(yīng)毒，通過與O/XJ/10-11原始毒比較，P1基因由2 208個核苷酸組成，編碼736個氨基酸(圖3)，P1基因核苷酸序列同源性在99.6%～99.8%(圖4)，氨基酸序列同源性在99.3%～99.9%，核苷酸同源性高，均未出現(xiàn)堿基缺失現(xiàn)象(圖5)。核苷酸序列分析有18處變異，其中9處突變發(fā)生在密碼子第3位堿基上，為同義突變，不會造成所編碼的氨基酸突變；第2位堿基上的有5處；第1位堿基上的有4處。推導(dǎo)出的氨基酸序列比對中發(fā)生變異的有8處，且均由核苷酸第1、2位堿基突變而造成，為非同義突變?？梢?，氨基酸變異區(qū)明顯少于核苷酸變異區(qū)，表明病毒表型變化程度低于遺傳性變異程度。1A(VP4)由255個核苷酸組成，編碼1-85位氨基酸，均未發(fā)生變異；1B(VP2)由654個核苷酸組成，編碼86-303位氨基酸，其中VP2的70-80位和131-134位氨基酸殘基為抗原表位，發(fā)生3處變異且均在抗原表位上；1C(VP3)由660個核苷酸，編碼304-523位氨基酸，有2處變異；1D(VP1)由639個核苷酸組成，編碼524-736位氨基酸，有3處變異。VP1蛋白上氨基酸變異位點有3處，乳鼠適應(yīng)毒1處發(fā)生變異，變異點位于核苷酸序列第472位，由C變?yōu)門，氨基酸序列第158位由脯氨酸(P)變?yōu)榻z氨酸(S)，變異發(fā)生在FMDV主要抗原區(qū)域141-213位氨基酸區(qū)域上；豬適應(yīng)毒2處變異，變異點位于核苷酸序列第356位，由A變?yōu)镚，氨基酸序列第119位，由酪氨酸(Y)變?yōu)榘腚装彼?C)，核苷酸序列第532位，由T變?yōu)镃，氨基酸第178位，由酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)；牛適應(yīng)毒和BHK-21細胞適應(yīng)毒在VP1蛋白上均沒有變異。VP2蛋白上氨基酸變異位點有3處，牛適應(yīng)毒2處變異，變異位點位于核苷酸序列第235位，由T變?yōu)镃，氨基酸序列第79位，由酪氨酸(Y)變?yōu)榻M氨酸(H)，核苷酸序列第544位，由A變?yōu)镚，氨基酸序列第182位，由甲硫氨酸(M)變?yōu)槔i氨酸(V)；豬適應(yīng)毒1處變異，變異位點位于核苷酸序列第398位，由A變?yōu)镚，氨基酸第133位，由谷氨酸(E)變?yōu)楦拾彼?G)；乳鼠適應(yīng)毒和BHK-21細胞適應(yīng)毒在VP2上沒有變異。VP3蛋白上氨基酸變異位點有2處，均為BHK-21細胞適應(yīng)毒變異，變異位點在核苷酸序列第167位，由A變?yōu)镚，氨基酸序列第56位，由組氨酸(H)變?yōu)榫彼?R)，核苷酸序列第179位，由A變?yōu)镚，氨基酸序列第60位，由天冬氨酸(D)變?yōu)楦拾彼?G)；VP4基因的氨基酸位點上各宿主適應(yīng)毒的均沒有發(fā)生變異，最為最保守。

M.DNA 標準 DL 2 000；1～4.1A 339 bp，1.牛毒，2.豬毒，3.鼠毒，4.BHK-21細胞毒；5～8.1B 683 bp，5.牛毒，6.豬毒，7.鼠毒，8.BHK-21細胞毒；9～12.1C 780 bp，9.牛毒，10.豬毒，11.鼠毒，12.BHK-21細胞毒；13～16.1D 780 bp，13.牛毒，14.豬毒，15.鼠毒，16.BHK-21細胞毒； 17.陰性對照

圖3 P1基因核苷酸序列同源性

圖4 P1基因氨基酸序列同源性

圖5 P1基因氨基酸序列突變圖

3 討論

研究編碼衣殼蛋白的P1基因，能夠使我們進一步研究FMDV的相關(guān)基因功能，如P1基因在體外的功能特點及衣殼組裝、非結(jié)構(gòu)蛋白的功能等，而且P1區(qū)可能含有其他潛在的抗原表位，可能制備更好、更接近天然抗原的診斷試劑和基因工程疫苗，為今后建立安全、敏感、特異的診斷抗原以及新型疫苗提供新的思路和研究方向[14]。編碼FMDV結(jié)構(gòu)蛋白P1基因是構(gòu)成病毒衣殼的基礎(chǔ)，衣殼由于包含VP0、VP3和VP1,能誘導(dǎo)與感染性FMDV粒子相同的免疫反應(yīng)。VP1、VP2、VP3基因位于衣殼表面，是楔形的，具有相似的結(jié)構(gòu)，均由8個β-折疊桶和2個α-螺旋組成，每個β-折疊桶由2個4條鏈組成的β片層結(jié)構(gòu)組成，是構(gòu)成病毒衣殼的主要的抗原蛋白，與宿主的宿主范圍和毒力有一定的聯(lián)系。VP4基因位于FMDV粒子的內(nèi)部[15]不易發(fā)生變異，與其保守性有關(guān)。

本研究將FMDV不同宿主適應(yīng)毒進行比對分析，P1結(jié)構(gòu)蛋白核苷酸序列同源性比較高(99.6%以上)，氨基酸同源性在99.3%以上，未出現(xiàn)堿基缺失或增加現(xiàn)象。不同宿主適應(yīng)毒的變異，均發(fā)生在P1衣殼表面蛋白上，主要集中于VP1的主要抗原區(qū)域的141-160位和200-213位，VP2抗原表位的156-166位和217-220位，關(guān)鍵氨基酸發(fā)生了明顯的變化；VP3抗原蛋白也發(fā)生了氨基酸變異。對FMDV抗原表位的研究已經(jīng)非常多，主要的研究集中于其結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3。但是由于這3個構(gòu)蛋白的高變異性，因此其上的抗原表位也都有很大的變異性，基本都是特異性的抗原表位[16-17]。而結(jié)構(gòu)蛋白VP4不僅在不同血清型之間體現(xiàn)出其保守性，而且在本試驗中，在不同宿主適應(yīng)毒之間也均未變異，也體現(xiàn)出VP4蛋白是極其保守的蛋白。與毒力相關(guān)基因的改變將引起病毒宿主范圍和毒力方面的變化。對FMDV而言，柳紀省等[18]研究表明，VP1與FMDV的抗原性有關(guān)，而與宿主嗜性和持續(xù)性感染相關(guān)的基因可能存在于VP1之外。

本研究將緬甸98譜系FMDV在牛、乳鼠、豬、BHK-21細胞宿主進行攻毒試驗并連續(xù)傳代，分別獲得各宿主適應(yīng)毒，運用分子生物學技術(shù)及生物分析軟件，分析不同宿主P1(1A、1B、1C、1D)內(nèi)各段基因的變異情況，對FMDV宿主間遺傳變異趨勢、P1基因的結(jié)構(gòu)特征與宿主關(guān)系有了新的認識，為今后研究口蹄疫在宿主間傳染關(guān)系提供了基礎(chǔ)信息。

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Study on Variations of P1 Genes of Different Host-Adaptive Type O Foot-and-mouth Disease Virus

YAO Huai-bing1,3，ZHAO Yi2，ZHU Yan1，LIU Meng-li1，LIU Hong2，REN Fang2，HUANG Jiong3

(1.VeterinaryMedicineCollegeofXinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi,Xinjiang,830052China； 2.TeconBio-technologyCo，Urumqi,Xinjiang,830000，China；3.InstituteofVeterinaryMedicine，XinjiangAcademyofAnimalSciene，Urumqi，Xinjiang，830000，China)

In order to identify P1 gene sequence differences of different host-adaptive type O foot-and-mouth disease virus(FMDV) and study the trend of P1 genetic variation,FMDV was inoculated into cattle，neonatal mice，swine and BHK-21 cell line to obtain corresponding adapted virus.The RNA of FMDV in each adapted virus was taken as template for reverse transcription and amplification of P1(1A,1B,1C,1D) gene ,the sequences of each adapted virus amplified P1 gene were compared with each other.The results were as follows：different host-adapted virus nucleotide and amino acid sequences were no deletions；the mutation occurred in some of the key amino acids，the variation occurs in 141-160 and 213-200 in the main antigen region of VP1,156-166 and 217-220 in the antigen epitope region of VP2; less variation occurs in antigen protein region of VP3；no mutation occurs in region of VP4.The results provided important information for genome analysis of different host-adapted FMDV.

type O Foot-and-mouth disease virus; different host-adapted virus; P1 gene

2016-11-01

新疆維吾爾自治區(qū)科研機構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項資金(2016D04008)；新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)學研聯(lián)合培養(yǎng)研究生示范基地項目(xjaucxy-yjs-20152008)

姚懷兵(1990-)，男，新疆五家渠人，碩士研究生，主要從事動物口蹄疫病毒研究。*通訊作者

S852.659.6

A

1007-5038(2017)05-0011-06