孫奇，姜成剛

（1.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，哈爾濱 150069；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150069）

黑龍江省豬場潛在腸出血性大腸桿菌分離鑒定及其遺傳相關(guān)性分析

孫奇1，姜成剛2*

（1.黑龍江省獸藥飼料監(jiān)察所，哈爾濱 150069；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150069）

腸出血性大腸桿菌感染是由腸出血性大腸埃希桿菌（EHEC）引起的腸道傳染病。EHEC為出血性腸炎的病原，主要有大腸埃希桿菌O157 ? H7，是1982年新發(fā)現(xiàn)的一種致腹瀉大腸埃希桿菌。此外，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大腸桿菌也對人類公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅。黑龍江省養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)，試驗(yàn)在黑龍江省5個(gè)規(guī)?；i場采集發(fā)生腹瀉的仔豬糞便樣品，進(jìn)行腸出血性大腸桿菌分離鑒定及其遺傳相關(guān)性分析。

腸出血性大腸桿菌；仔豬；腹瀉；血清型

腸出血性大腸桿菌是重要食源性病原之一，可以引起嚴(yán)重的胃腸道疾病，包括致死性感染，在世界范圍內(nèi)均有發(fā)病的報(bào)道[1]。EHEC不僅產(chǎn)生潛在細(xì)胞毒性，而且還獲得緊密方式粘附與腸粘膜上[2]。往往通過菌株攜帶的毒力因子而進(jìn)行命名，因此菌株都攜帶溶血素毒力基因（大多數(shù)產(chǎn)生一個(gè)EHEC特異溶血素編碼的質(zhì)粒，hlyA基因編碼），攜帶一種志賀菌株（stx1或stx2），許多菌株還產(chǎn)生致密素，97 ku粘附蛋白，由eaeA基因編碼[3-5]。雖然在世界各地大腸桿菌O157為主要EHEC血清表型，其他血清型如O5、O26、O91、O111和O113大腸桿菌也對人類公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重威脅[6]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016年黑龍江省5個(gè)規(guī)?；i場仔豬發(fā)生腹瀉，采集肛門拭子120份，至含15%甘油生理鹽水中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)菌分離鑒定

通過大腸桿菌顯色培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）分離純化菌株，并應(yīng)用大腸桿菌生化試紙條API 20 E（法國梅里埃）及大腸桿菌特異性16SRNA基因PCR進(jìn)行鑒定[7]。

1.3 毒力因子檢測

設(shè)計(jì)stx1、stx2、eaeA和ehxA基因引物，并送至上海invitrogen生物技術(shù)有限公司合成引物[8-10]。應(yīng)用北京全式金生物技術(shù)有限公司Easy Pure Ge?nomic DNA Kit提取細(xì)菌DNA，2×EasyTaq PCR Su?per Mix試劑盒對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA模板4 μL，上游引物1 μL（10 mmo·L-1），下游引物1 μL（10 mmo·L-1），2×EasyTaq PCR Su?per Mix 12.5 μL，ddH2O 6.5 μL，總體系25 μL?；驍U(kuò)增反應(yīng)條件根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，點(diǎn)樣于1%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1溴化乙錠），以DNA Marker DL2000作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，在120 V的電場強(qiáng)度下，于1×TAE緩沖液中電泳30 min，結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.4 分離株血清型鑒定

在中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購買大腸桿菌O抗原陽性血清，按照使用說明書，利用玻板、試管凝集試驗(yàn)測定O抗原類型。

1.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法（K-B）進(jìn)行分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)。將菌液稀釋至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，用滅菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布于普通瓊脂平板表面，待平板表面干燥后，用小鑷子夾取抗生素紙片，按一定距離分別貼于平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)24 h取出，用卡尺測量抑菌圈的直徑，根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)，判定其對各種藥物的敏感性[11]。分別選取四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨芐青霉素、哌拉西林、氯霉素、頭孢呋辛、鏈霉素、丁胺卡那霉素、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、磺胺合劑共計(jì)12種藥敏紙片進(jìn)行試驗(yàn)。

1.6 菌株遺傳進(jìn)化分析

采用基因間重復(fù)單位EIRC-PCR方法，合成引物EIRC2：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'，PCR反應(yīng)體系，總體積25 μL中10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，引物2 μL（10 pmol），TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA模板2.5 μL，雙蒸水15.5 μL；以TE代替模板做空白對照。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min（第1個(gè)循環(huán)），然后94℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸4.5 min，以此進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸1min后結(jié)束反應(yīng)[12]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，電泳1 h，凝膠成像儀觀察拍照，記錄結(jié)果。對于EIRC-PCR電泳指紋，用Quantity One軟件采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UpGMA）聚類，生成分離菌株遺傳進(jìn)化樹形圖。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌株的分離

將肛門拭子接種到大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，挑取典型大腸桿菌藍(lán)綠色菌落接種到液體LB培養(yǎng)基純培養(yǎng)，經(jīng)過生化反應(yīng)和16SRNA PCR鑒定，共分離豬源大腸桿菌78株。

2.2 菌株毒力因子鑒定

毒力因子PCR檢測結(jié)果表明，有34株大腸桿菌攜帶ehxA基因，占總數(shù)的43.6%；有2株同時(shí)攜帶ehxA和eaeA基因；有1株同時(shí)攜帶ehxA、eaeA和stx1基因。

2.3 菌株血清型鑒定

經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察大腸桿菌陽性血清凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除2株未能鑒定出血清型，其余菌株分布于9種血清型中，優(yōu)勢血清型為O92（9株）、O4（7株）和O26（5株），分別占總數(shù)的26.5%、20.6%和14.7%。同時(shí)2株攜帶ehxA和eaeA基因菌株血清型分別為O26和O92，1株，同時(shí)攜帶ehxA、eaeA和stx1基因血清型為O26。

2.4 菌株藥物敏感性

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，臨床分離株對四環(huán)素耐藥性最高達(dá)100%，余下依次為環(huán)丙沙星為94.5%，氨芐青霉素為93.6%，哌拉西林為90.2%，氯霉素為82.6%，頭孢呋辛為78.6%，鏈霉素為66.7%，丁胺卡那霉素為57.2%，頭孢他啶為42.9%，慶大霉素為33.4%，妥布霉素為19.1%，磺胺合劑為18.3%。該豬場34株攜帶ehxA大腸桿菌均有不同程度的耐藥，而且均表現(xiàn)多重耐藥，最小3耐，最多11耐，平均達(dá)7耐。攜帶ehxA毒力基因大腸桿菌中，耐藥性均在6耐以上，其中O26血清型均在8耐以上，其中攜帶ehxA、eaeA和stx1 3種毒力基因的大腸桿菌為11耐，僅對妥布霉素敏感。

2.5 菌株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果

應(yīng)用EIRC2引物對分離菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖電泳顯示在7 500 bp以下呈現(xiàn)大小不等的擴(kuò)增片段，根據(jù)菌株條帶分子大小和個(gè)數(shù)的不同，應(yīng)用Quantity One軟件，聚類方法采用UP? GAMA進(jìn)行分析。從遺傳距離生成的樹形圖（附圖）可知，在相似性系數(shù)0.49時(shí)78株人腸桿菌明顯分成A、B、C、D、E、F、G、H，8個(gè)基因型，主要基因型為D型，19株菌，占分型菌株的24.4%；其次基因型為H型，16株菌，占分型菌株的20.5%；最少基因型為基因A型只有2株菌。34株攜帶ehxA毒力因子大腸桿菌分不在7個(gè)不同群，B群2株、C群3株、D群8株、E群8株、F群3株、G群4株、H群6株。同時(shí)攜帶ehxA和eaeA2株菌分別在H群和D群，同時(shí)攜帶ehxA、eaeA和stx1菌株在H群。

附圖 豬源大腸桿菌遺傳進(jìn)化分析

3 討論

本研究報(bào)道了5個(gè)大型豬場發(fā)生腹瀉，對流行大腸桿菌特性進(jìn)行分析，以往致豬腹瀉大腸桿菌常為K88、K99、F41、F18及987P[13]。而本研究關(guān)注點(diǎn)為致腹瀉大腸桿菌攜帶ehxA、eaeA及stx1和stx2的情況，以評價(jià)對人類潛在威脅，本研究表明，在黑龍江省發(fā)生仔豬腹瀉大型豬場中，分離大腸桿菌攜帶ehxA占43.6%，ehxA毒力基因以往研究表明在牛腹瀉病例中攜帶較高，在牛STEC菌株中溶血素毒力基因攜帶率為46.7%～70.0%，在豬源大腸桿菌中相關(guān)報(bào)道較少[14-15]。溶血素毒力基因廣泛分布在STEC菌株中，雖然該毒力基因引起腹瀉的機(jī)理還不是十分清楚，但這個(gè)基因與志賀毒素存在某些協(xié)同作用，其也常常用來判定產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的診斷標(biāo)記物[16]。

大腸桿菌通常存在于動(dòng)物和人類的腸道內(nèi)。目前，大腸桿菌通常用來檢測飲用水是否安全的一項(xiàng)重要指標(biāo)。有幾種途徑可以造成大腸桿菌對水源的污染，包括人類、養(yǎng)殖場、野生動(dòng)物、水禽及寵物[17-18]。確定水源污染大腸桿菌來源途徑，對于建立正確風(fēng)險(xiǎn)評估機(jī)制和預(yù)防措施都十分重要。

在哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)大部分大腸桿菌都是共生無害的，而某些菌株可以引起人類發(fā)生疾病。大腸桿菌可以產(chǎn)生志賀毒素（stx1和stx2），為產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC），可以引起人類血性腹瀉以及潛在致命性疾病，包括溶血性尿毒血癥HUS和出血性腸炎，許多STEC菌株攜帶一個(gè)大的毒力質(zhì)粒（60～121 kb），編碼各種毒力因子，包括溶血素毒力基因（由ehxA基因編碼）[19-20]。

一些致病性STEC菌株同樣攜帶位于染色體上的毒力島，簡稱腸道上皮細(xì)胞損傷位點(diǎn)（LEE），這些菌株通常稱為腸溶血性大腸桿菌（EHEC），LEE區(qū)域包含一個(gè)編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)編碼的基因和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些蛋白對于大腸桿菌的粘附及致病變作用是必需的，如致密素（由eae基因編碼），LEE對于大腸桿菌初級階段的感染起到重要作用，從病人分離菌株大多數(shù)發(fā)生HUS綜合征的STEC株往往都LEE陽性，然而這個(gè)區(qū)域引起人類疾病不是必需的，在發(fā)生HUS綜合征的病人分離菌株也存在缺少LEE毒力島的STEC菌株[19,21-22]。由于LEE區(qū)域基因遺傳保守型，檢測eae基因可以用來表明整個(gè)LEE區(qū)域的存在[23]。

本研究中分離的菌種共分布在17種血清型中，攜帶毒力因子的血清型主要為O92、O4和O26，其中血清型O26與其他哺乳類動(dòng)物和人類大腸桿菌強(qiáng)致病性菌株相一致，存在不同種屬動(dòng)物之間及動(dòng)物與人類之間傳播的可能。由于抗生素濫用，豬源性細(xì)菌耐藥性也十分嚴(yán)重，本研究分離菌株呈現(xiàn)多重耐藥性，攜帶三毒力因子（ehxA、eaeA和stx1）菌株為11耐，超級細(xì)菌的出現(xiàn)正是攜帶超強(qiáng)毒力因子與超強(qiáng)耐藥基因的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的產(chǎn)物。

應(yīng)用EIRC方法對分離菌株進(jìn)行基因進(jìn)化分析，結(jié)果表明攜帶毒力基因的菌株主要在H群和D群。攜帶毒力基因的質(zhì)粒可以通過轉(zhuǎn)接和轉(zhuǎn)化等方式在菌株中互相傳播，使無致病力菌株或低致病力菌株變?yōu)閺?qiáng)致病力菌株，耐藥性也可以通過耐藥質(zhì)粒進(jìn)行傳播，使致病菌的耐藥性進(jìn)一步增強(qiáng)，如果不加以控制，動(dòng)物源性的超級細(xì)菌就會慢慢產(chǎn)生，勢必對人類公共衛(wèi)生安全造成巨大威脅[24]。

4 小結(jié)

綜上所述，攜帶ehxA毒力基因的豬源大腸桿菌可以引起仔豬腹瀉，ehxA可以編碼于噬菌體，導(dǎo)致其在大腸桿菌中持續(xù)傳播，在發(fā)生腹瀉豬大量分離到EHEC菌株。暗示豬也是EHEC一個(gè)重要宿主，也大大增加從養(yǎng)殖場傳播給人類潛在致病性，應(yīng)該引起獸醫(yī)工作者足夠重視[25-32]。

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Isolation Identification and Genetic Correlation Analysis of Escherichia coliIsolated from Swine Farms in Heilongjiang Province

SUN Qi1,JIANG Chengang2*

（1.Heilongjiang Provincial Veterinary Medicine Feed Monitoring Institute,Harbin 150069,China；
2.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150069,China）

Enterohemorrhagic Escherichia coli infection is a kind of intestinal infectious disease caused by EH?EC.EHEC is the causative agent of hemorrhagic enteritis,mainly Escherichia coli O157:H7,was a new discovery in 1982 caused by diarrhea Escherichia coli.In addition,other serotypes such as O5,O26,O91,O111,and O113 also posed a serious threat to human health.The test collected fecal samples of diarrhea piglets,isolation and identification of Escherichia coli and analysis of the genetic correlations in Heilongjiang Province 5farms.

Escherichia coli;piglet;diarrhea;serotype

S828；S852.61+2

A

1001-0084（2017）03-0042-05

2017-02-14

孫奇（1989-），男，吉林長春人，助理畜牧師，研究方向?yàn)楂F藥及飼料檢驗(yàn)檢測。

*通訊作者：副研究員，E-mail:jcg5168@163.com。