徐少華，閆清華，劉國(guó)華，羅燕，譚磊

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東深圳 518005）

液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定烏雞中氟喹諾酮的方法對(duì)比

徐少華，閆清華，劉國(guó)華，羅燕，譚磊

（深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東深圳 518005）

以液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法為基礎(chǔ)，在試驗(yàn)前處理方面進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)添加回收試驗(yàn)和陽(yáng)性樣品檢測(cè)，對(duì)比液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法和優(yōu)化后的前處理兩種方式試驗(yàn)的結(jié)果。優(yōu)化的前處理過(guò)程：稱(chēng)取試樣3.0 g，加入提取液10 mL，經(jīng)球磨機(jī)研磨，超聲波輔助提取，冷凍離心。移取上清液過(guò)固相萃取柱，移取凈化液3.00 mL氮吹至0.5 mL，加入流動(dòng)相定容，過(guò)0.22μm膜上機(jī)。10、50、100、200、800、5000μg·kg-16個(gè)濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R均> 0.998?；厥章试囼?yàn)10、50、200 μg·kg-13個(gè)濃度對(duì)比，回收率范圍為85.6%～102.2%，RSD≤3.92%。20份不同濃度陽(yáng)性樣品，兩種方法檢測(cè)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%～19.6%。優(yōu)化后的前處理方法不但操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，大幅降低檢測(cè)成本，而且測(cè)定值穩(wěn)定可靠，可提高大批量雞肉中氟喹諾酮類(lèi)藥物的陽(yáng)性篩選效率。

液相質(zhì)譜；氟喹諾酮；前處理；陽(yáng)性樣品；烏雞

氟喹諾酮類(lèi)（FQNS）藥物是一類(lèi)人工合成的廣譜抗菌藥，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛、組織藥物濃度高、蛋白結(jié)合率低、使用方便、不良反應(yīng)小及價(jià)格低廉等特點(diǎn)[1]。廣泛用于動(dòng)物和人類(lèi)的各種感染性疾病的治療。隨著在養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用，僅20多年，耐藥率已經(jīng)達(dá)60%～70%[2]。FQNS類(lèi)藥物殘留不但對(duì)人體有直接的危害，更為嚴(yán)重的是致病菌對(duì)其耐藥性正逐漸增強(qiáng)，且已發(fā)現(xiàn)某些FQNS具有潛在致癌性，其殘留問(wèn)題已引起廣泛的關(guān)注，各種殘留檢測(cè)方法也應(yīng)運(yùn)而生[3]。

目前我國(guó)對(duì)FQNS的檢測(cè)已經(jīng)常態(tài)化，各級(jí)監(jiān)管單位都已將該類(lèi)藥物監(jiān)控作為例行任務(wù)。氟喹諾酮類(lèi)藥物在烏雞中的檢出率比較高。獸藥殘留的檢測(cè)主要分兩個(gè)部分，即樣品前處理和儀器檢測(cè)，傳統(tǒng)的前處理方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工作量占整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的70%，分為提取、凈化、濃縮、復(fù)溶4部分。本試驗(yàn)是將液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的前處理方法優(yōu)化之后，在保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性的前提下，可以將工作量和檢測(cè)成本大大降低。

1 試驗(yàn)材料

1.1 設(shè)備與儀器

設(shè)備與儀器包括球磨機(jī)、AB SECIX4500 LCMS、高速冷凍離心機(jī)、固相萃取柱裝置、氮吹儀、超聲波清洗器、默克超純水器。

1.2 試劑與材料

標(biāo)準(zhǔn)品：恩諾沙星（ENR）、環(huán)丙沙星（CIP）、達(dá)氟沙星（DAN）和沙拉沙星（SAR）均產(chǎn)自德國(guó)Dr. Ehrenslorfer公司，純度均≥99.6%，甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純。

提取液：80乙腈+20水+0.2甲酸；

流動(dòng)相：10甲醇+90水+0.2甲酸；

Waters Oasis?HLB 6cc（200 mg）Extraction Car?tridges固相萃取儀小柱；

Waters Oasis?PRiME HLB 6cc（200 mg）Extrac?tion Cartridges固相萃取小柱。

樣品：烏雞肉均為市售經(jīng)初步測(cè)定后選擇的陽(yáng)性樣品。

2 試驗(yàn)方法

2.1 儀器條件

流動(dòng)相梯度條件見(jiàn)表1，質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

色譜柱：Waters Acqdity ΜPLC@BEH C18 1.7 μm 3.0×100 mm；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5.00 μL；離子化模式：ESI+；質(zhì)譜掃描方式：MRM；離子源:電噴霧正離子源；電噴霧電壓：5 495 V；輔助氣溫度：500℃。

表1 流動(dòng)相梯度條件

表2 質(zhì)譜條件

流動(dòng)相條件：流速為0.3 mL·min-1。

2.2 工作曲線

取FQNS標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（用甲醇溶解），用流動(dòng)相稀釋定容，配置成工作液，濃度分別為10、50、100、200、800、5 000 μg·kg-1。

2.3 前處理步驟

2.3.1 方法一

按照國(guó)標(biāo)前處理方法，參考液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。

2.3.2 方法二

準(zhǔn)確稱(chēng)取已切碎的試樣3.0 g，置于已裝好陶瓷珠的離心管中，加入提取液10 mL，經(jīng)過(guò)球磨機(jī)充分研磨，放于超聲波清洗器中超聲5 min，置于冷凍離心機(jī)8 000 r·min-1，4℃條件下離心5 min。移取上清液5.0 mL于Waters Oasis?PRiME HLB 6cc（200 mg）Extraction Cartridges固相萃取小柱凈化，用玻璃試管接住過(guò)柱液，待提取液全部自然流出，無(wú)需擠干，將凈化液移取3.0 mL至帶刻度的5 mL試管中，氮吹至0.5 mL，加入流動(dòng)相定容至1.0 mL，渦旋混勻0.5 min，過(guò)0.22 μm水相膜，待上儀器測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

氟喹諾酮類(lèi)藥物保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見(jiàn)表3。由表3可知，以空白雞肉樣品為基質(zhì)，添加濃度為20 μg·kg-1，按照上述方法二全過(guò)程進(jìn)行預(yù)處理和測(cè)定，平行樣品n=7，根據(jù)各樣品檢測(cè)值，計(jì)算出平均值X（0.096 7 μg·L-1）及標(biāo)準(zhǔn)偏差Sb（0.003 91），當(dāng)被分析物的回收率在70%～120%時(shí)，可計(jì)算檢出限如表3。

計(jì)算公式如下：檢出限（MDL）=（k×Sb×C）/X，其中k為置信因子，一般取3。Sb表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3.2 回收率試驗(yàn)對(duì)比

四種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留加標(biāo)回收率見(jiàn)表4。

表3 氟喹諾酮類(lèi)藥物保留時(shí)間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

表4 4種氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留加標(biāo)回收率（n=2）

加標(biāo)回收率試驗(yàn)過(guò)程中，以?xún)煞N方法分別做單點(diǎn)定量，進(jìn)行不同濃度梯度的回收率測(cè)定對(duì)比。通過(guò)空白基質(zhì)樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)對(duì)比，加標(biāo)水平在10、50、200 μg·kg-1時(shí)，通過(guò)方法一和方法二做雙平行回收率試驗(yàn)，前處理優(yōu)化后的方法回收率均穩(wěn)定，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。與液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的試驗(yàn)效果相近，表明該優(yōu)化后的前處理方法比較穩(wěn)定，可以用于大規(guī)模的檢測(cè)篩查，是較為理想的檢測(cè)方法。

3.3 陽(yáng)性樣品實(shí)測(cè)結(jié)果對(duì)比

陽(yáng)性樣品試驗(yàn)結(jié)果以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表5。

由表5可知，選取20份不同濃度等級(jí)的烏雞肉陽(yáng)性樣品通過(guò)方法一和方法二兩種前處理方法進(jìn)行雙平行試驗(yàn)測(cè)定，在烏雞肉陽(yáng)性樣品檢測(cè)中，通過(guò)兩種不同前處理方法，試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果存在一定偏差，測(cè)定出的恩諾沙星濃度范圍為2～5 100 μg·kg-1，環(huán)丙沙星測(cè)定濃度范圍為4～100 μg·kg-1，同一份樣品兩種方法檢測(cè)平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為0.67%～19.6%，82.6%的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)方法一前處理的陽(yáng)性樣品檢出值要稍高于方法二，但是提取效果接近?？赡苁且?yàn)榉Z酮類(lèi)藥物更容易從肌肉組織中提取出來(lái)，方法二中直接用乙腈水溶液作為提取劑的效果不如方法一的提取劑。但是由于雞肉中富含大量脂肪和蛋白質(zhì)，在液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法的前處理方法過(guò)程中，EDTA-Mcll?vaine緩沖液會(huì)攜帶大量蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸等干擾物質(zhì)，樣品組織提取液一般呈渾濁狀態(tài)，即使通過(guò)冷凍離心，仍然無(wú)法有效去除干擾物，提取液進(jìn)入固相萃取柱后，凈化效果并不理想，而且會(huì)造成小柱的堵塞，前處理6個(gè)樣品的時(shí)間約為6 h，增大了殘留藥物檢測(cè)難度。通過(guò)改進(jìn)后的方法二進(jìn)行前處理，6個(gè)樣品的時(shí)間縮至約2 h，而且步驟簡(jiǎn)單，回收率高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，在保證一定的測(cè)定準(zhǔn)確度的前提下，可以大幅提高工作效率，并且節(jié)省耗材及人工成本。鑒于我國(guó)日益重視食品安全問(wèn)題，政府加大對(duì)畜禽產(chǎn)品的檢測(cè)監(jiān)督工作的背景下，可借鑒該改進(jìn)后的前處理方法，在成本一定的情況下，相對(duì)于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法可以成倍增加檢測(cè)篩查批次，在食品安全監(jiān)控方面起到更加高效的監(jiān)測(cè)目的。

表5 陽(yáng)性樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

[1]張家禾,孟婷,周作紅,等.動(dòng)物性食品中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014,41（5）:262-266.

[2]潘媛,牛華,程曉云,等.高效液相色譜法檢測(cè)六種氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留前處理的優(yōu)化[J].分析試驗(yàn)室,2011,30（5）:69-72.

[3]邊永玲,李秀娟,郭建.氟喹諾酮類(lèi)獸藥殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24（6）:28-31.

LC-MS Method of Determination of Fluoroquinolone in Silkie

XU Shaohua,YAN Qinghua,LIU Guohua,LUO Yan,TAN Lei

（Shenzhen Agricultural Product Quality Safety Inspection Testing Center,Shenzhen 518005,Guangdong China）

Based on liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry,the test pretreatment was opti?mized,by adding the recycling experiment and positive samples test,compared with liquid chromatography mass spec?trometry/mass spectrometry and the optimized pretreatment results.Optimization of pretreatment process:took sample 3.0 g adding extract 10 mL,grinding by ball mill,ultrasonic assisted extraction and refrigerated centrifuge.Moving the clear liquid to the solid phase extraction column,the purified liquid 3.00 mL nitrogen blowing to 0.5 mL,adding mo?bile phase capacitance over 0.22 um membrane computer.Test selected 10,50,100,200,800,5 000 u g·kg-1six lev?els to establish standard curve,correlation coefficient R was greater than 0.998.Recovery experiment was 10,50,200 ug·kg-1three concentrations of contrast,recovery range 85.6%～102.2%,RSD 3.92%or less.Twenty different con?centration positive sample of the two methods,relative standard deviation was between 0.67%～19.6%.The optimized pretreatment method was not only the operation simple,save time and effort,greatly reduce the testing cost,and stable and reliable measurements.The method could improve the mass of the chicken positive screening efficiency.

liquid mass spectrometry;fluoroquinolone;preliminary treatment;positive samples;silkie

S859.79+6；S831

A

1001-0084（2017）03-0006-04

2017-01-24

徐少華（1991-），男，浙江衢州人，助理工程師，主要從事于獸藥殘留檢測(cè)工作。