高春蘭，陳 麗，王偉邦，張 鑫，鄒曉燕，李 蕊，李 穎

·論 著·

FOXO1表達(dá)改變在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的關(guān)聯(lián)性研究

高春蘭，陳 麗，王偉邦，張 鑫，鄒曉燕，李 蕊，李 穎

目的 研究糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者FOXO1基因表達(dá)改變，進(jìn)一步了解DR的發(fā)病機(jī)制，為DR的治療提供新的基因靶點(diǎn)和依據(jù)。方法 收集眼科、內(nèi)分泌科住院部及門診糖尿病(DM)患者的臨床資料，分為DR組110例，糖尿病正常眼底組(NDR)120例。以熒光定量PCR方法檢測FOXO1 mRNA表達(dá)水平，用Western blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 DR組與NDR組相比，F(xiàn)OXO1 mRNA表達(dá)在DR組中顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DR組中FOXO1蛋白表達(dá)水平水平相比較NDR組明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 FOXO1在DR中的表達(dá)明顯改變，這可能為DR提供潛在的治療靶點(diǎn)。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1

目前，糖尿病(DM)患者人群呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]，我國已超越印度成為了世界上罹患糖尿病人數(shù)最多的國家，成人糖尿病患病率高達(dá)10.1%[2]。糖尿病作為一種終身性代謝疾病，血糖代謝紊亂及利用失衡易造成全身多處器官出現(xiàn)病理性改變[3]，如糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病足等，使患者生活質(zhì)量明顯下降，嚴(yán)重危害患者身體健康。DR特征為視網(wǎng)膜微血管功能的異常，其眼底病變具有特異性改變，DR的發(fā)生、發(fā)展與代謝紊亂、遺傳調(diào)控等因素密切相關(guān)[4-5]。近年來國內(nèi)外許多研究表明，F(xiàn)OXO1廣泛表達(dá)于重要的胰島素感應(yīng)器官，如胰腺、肝臟和脂肪組織等，主要參與肝臟的糖異生調(diào)節(jié)，調(diào)控胰島素β細(xì)胞的功能成長，調(diào)控脂肪和肌肉的分化及代謝[6-8]，提示FOXO1基因可能為DR的易感基因。然而，F(xiàn)OXO1在DR中的作用機(jī)制尚不清楚，因此探討FOXO1表達(dá)改變在DR中的作用，將有助于進(jìn)一步了解DR的發(fā)病機(jī)制，為DR的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集所有樣本病例均近期未服用抗凝血藥物，并排除肝腎功能不全、心腦血管疾病、急性和慢性感染患者。實(shí)驗(yàn)組(DR組)為2013年1月-2016年6月在本院眼科及內(nèi)分泌科門診、住院部確診為2型糖尿病患者，DR分型采用2002年悉尼國際眼科學(xué)會議制定的DR國際分型，依據(jù)直接眼底鏡檢查、眼底拍片以及眼底熒光血管造影檢查確診患者為DR，共110例，男53例，女47例，年齡(60.21±2.59)歲。對照組(NDR組)為同期糖尿病正常眼底患者，符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病分型標(biāo)準(zhǔn)，均未發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變，共120例，其中男性57例，女性63例，平均年齡(62.83±3.62)歲。

1.2 方法:DM患者均進(jìn)行問卷調(diào)查、生化檢測和眼科?？茩z查。問卷調(diào)查包括患者年齡、性別、DM病程、飲食習(xí)慣、是否有家族史等，并進(jìn)行空腹血糖、糖化血紅蛋白等實(shí)驗(yàn)室生化檢測項(xiàng)目；眼科專科檢測包括裸眼視力、矯正視力、眼壓、直接檢眼鏡眼底檢查、散瞳后眼底拍片、眼底熒光血管造影等。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)室基本指標(biāo)檢測：所有患者病史資料采集后，于早晨空腹采患者外周靜脈血5 mL于促凝管中30 min后離心，分離出血清標(biāo)本后，2 h內(nèi)采用Olympus AU2700型全自動生化分析儀，分別檢測各個樣本空腹血糖、糖化血紅蛋白等指標(biāo)，其余血清-20 ℃冰箱保存留作檢測FOXO1基因。

1.2.2 實(shí)時定量熒光PCR(qRT-PCR)法檢測血液中FOXO1的表達(dá)： 根據(jù)Trizol 試劑盒說明書提取患者外周血RNA，用GeneBank 數(shù)據(jù)庫查詢基因序列，設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)OXO1上游引物 5'-TGAAACCATTACATCATCAC-3'，下游引物 5'-ATTAGA ATGTCC GCT TCG-3'，產(chǎn)物長度為168 bp。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共45個循環(huán)。并設(shè)空白對照和內(nèi)參(GADPH)對照同體系擴(kuò)增目的基因的相對量，根據(jù)公式2-△△Ct計(jì)算，△△Ct=[CtASPP2(待測樣本)-CtGADPH(待測樣本)][CtASPP2(校正樣本)-CtGADPH(校正樣本)]。

1.2.3 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測外周血中FOXO1蛋白表達(dá)： 取30 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸至變性，經(jīng)SDS/PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后與1∶1 000稀釋的一抗在4 ℃孵育過夜，再與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，PBST清洗3次，每次5 min，曝光。掃描分析使用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)，以目的條帶面積灰度值做半定量檢測標(biāo)定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 2組患者一般臨床資料比較:2組患者在年齡、性別比例和空腹血糖比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病程、糖化血紅蛋白含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示病程及糖化血紅蛋白含量與糖尿病發(fā)生視網(wǎng)膜并發(fā)癥相關(guān),見表1。

2.2 DR患者中FOXO1 mRNA的表達(dá):為了明確FOXO1 mRNA 在DR患者外周血中的表達(dá)改變，用熒光定量PCR技術(shù)檢測以了解其表達(dá)水平，與NDR組相比，DR組FOXO1 mRNA表達(dá)升高了1.93倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.816，P<0.05)，提示在DR發(fā)生發(fā)展中FOXO1可能發(fā)揮了重要作用(圖1)。

表1 2組患者各項(xiàng)指標(biāo)的比較±s)

2.3 DR患者中FOXO1蛋白表達(dá):用Western blot技術(shù)檢測了FOXO1蛋白表達(dá)水平，DR組與NDR組相比FOXO1蛋白表達(dá)升高了2.93倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.865，P<0.05)，與FOXO1 mRNA表達(dá)一致，進(jìn)一步證實(shí)在DR中FOXO1可能發(fā)揮了重要的作用(圖2)。

圖1 各組外周血中FOXO1 mRNA的表達(dá)

圖2 各組外周血中FOXO1 蛋白的表達(dá)

3 討論

作為DM最常見且最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一[9]，DR是一種以微血管瘤、血管通透性增加、血管閉塞及新生血管形成為主要表現(xiàn)的高度特異性糖尿病微血管病變，占2型糖尿病患者的30%左右，病變嚴(yán)重者會導(dǎo)致患者視力喪失，已成為糖尿病致盲的重要原因，且目前尚無良好的治療方法[10]。研究表明[11]，2010年以來，我國DM患者大幅度增加，總?cè)藬?shù)超過1億，成為全世界糖尿病患病人數(shù)增長最快的國家，且糖尿病患者致盲率是非糖尿病患者的25倍之多[12]。同時，流行病學(xué)調(diào)查[13]已經(jīng)證實(shí)，DR的發(fā)病率與DM病程關(guān)系密切呈正相關(guān)性，病程達(dá)15年以上的患者中約60%出現(xiàn)眼部血管病變，臨床表現(xiàn)為視物模糊、視力下降等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致失明；不但降低了患者生活質(zhì)量，造成不可挽回的視覺傷害，同時也為社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為了社會公共健康問題。

FOXO1是胰島素信號下游的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于重要的胰島素感應(yīng)器官，在肝臟和脂肪組織的胰島素信號傳遞中發(fā)揮非常重要的作用，可以調(diào)節(jié)β細(xì)胞分化與增殖、脂肪和葡萄糖的代謝等[8,14]。有研究表明，F(xiàn)OXO1在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，F(xiàn)OXO1 可以通過調(diào)節(jié)糖異生相關(guān)基因的表達(dá)，對肝臟組織中的糖代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，對維持正常的血糖水平起著重要的作用[15]。FOXO1蛋白能夠通過與糖異生關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)基因啟動子的胰島素反應(yīng)元件(IRE)結(jié)合，調(diào)節(jié)這兩種基因的表達(dá)，可見FOXO1在糖尿病的病程進(jìn)展中具有重要作用。本研究收集大量臨床資料，并采集臨床標(biāo)本，對患者外周血中FOXO1的mRNA及蛋白水平進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)DR組相較于NDR組FOXO1的表達(dá)顯著增高，從轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個水平證實(shí)了FOXO1表達(dá)改變在DR的發(fā)生發(fā)展中可能起到關(guān)鍵作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Alekseev I，Kochergin S，Vorobeva I，et al.On some pathogenic features of diabetic retinopathy in type Ⅱ diabetes mellitus and the role of antioxidants and ginkgo biloba[J].Vestnik Oftalmologii，2013，129(3):89-93.

[2] 安淑霞，郭緒榮，張愛月，等.糖尿病發(fā)病率相關(guān)因素調(diào)查及護(hù)理干預(yù)[J].護(hù)理實(shí)踐與研究，2013，10(11)：148-149.

[3] Bourne R，Jonas J，F(xiàn)lazman S，et al.Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Easter and Central Europe:1990-2010[J].The British Journal of Ophthalmology，2014，98(5):629-638.

[4] 蘭文，陸燕，王春紅，等.糖尿病視網(wǎng)膜病變炎癥的研究新進(jìn)展[J].眼科新進(jìn)展，2013，33(2)：197-200.

[5] Kaul K，Hodgkinson A，Tarr JM，et al.Is inflammation a common retinal-renal-nerve pathogenic Link in diabetes[J].Current Diabetes Reviews，2010，6(5):294-303.

[6] Wang Q，Ren J.mTOR-Independent autophagy inducer trehalose rescues against insulin resistance-induced myocardial contractile anomalies:role of p38 MAPK and Foxo1[J].Pharmacological Research，2016，111(9):357-373.

[7] 唐媛，程熠，喬乙春，等.FOXO1基因多態(tài)性與2型糖尿病易感性的關(guān)聯(lián)性分析[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2013，39(1)：87-91.

[8] Rajan M，Nyman E，Kjlhede P，et al.Systems-wide Experimental and Modeling Analysis of Insulin Signaling through Forkhead Box Protein O1 (FOXO1)in human adipocytes，normally and in type 2 diabetes[J].The Journal of Biological Chemistry，2016，291(30):15806-15819.

[9] 崔穎，郭?？?，韓云飛，等.2型糖尿病住院患者糖尿病視網(wǎng)膜病變患病率及危險因素分析[J].眼科新進(jìn)展，2012，32(8)：736-739.

[10] 韓佩晏，呂紅彬.糖尿病視網(wǎng)膜病變與凋亡相關(guān)因子的研究進(jìn)展[J].國際眼科雜志，2016，16(5)：859-863.

[11] 楊文英.糖尿病和糖尿病前期的診斷[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21(4)：401-404.

[12] 張承芬，張惠蓉.糖尿病的眼部并發(fā)癥及治療[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：120.

[13] Scanlon PH，Aldington SJ，Stratton IM.Epidemiological issues in diabetic retinopathy[J].Middle East African Journal of Ophthalmology，2013，20(4):293-300.

[14] Barber AJ，Gardner TW，Abcouwer SF.The significance of vascular and neural apoptosis to the pathology of diabetic retinopathy[J].Investigative Ophthalmology & Visual Science，2011，52(2):1156-1163.

[15] Ichiyama K，Gonzalez Martin A，Kim B，et al.The Micro RNA-183-96-182 cluster promotes T helper 17 cell pathogenicity by negatively regulating transcription factor FOXO1 expression[J].Immunity，2016，44(6):1284-1298.

The study on FOX O1 expression in diabetic retinopathy

GAOChunlan,CHENLi,WANGWeibang,ZHANGXin,ZOUXiaoyan,LIRui,LIYing.

DepartmentofOphtalmology,TheFirstPeople’sHospitalofYinchuan,Yinchuan750001,China

Objective The study the of forkhead box transcription factor O1 (FOXO1) expression in patients with diabetic retinopathy (DR),provide experiment evidences for further explore the mechanisms of DR developing and target therapy of for DR.Methods The glycosylated hemoglobin content were measured check-ups and ophthalmology with automatic biochemical analyzer；the protein and mRNA expressions of FOXO1 were detected by western blotting and real time polymerase chain reaction (RT-PCR).Results General data analysis presents that the course of the disease is longer in DR group.Compared with the NDR group,the mRNA and protein expressions of FOXO1 in DR were increased obviously (P<0.05).Conclusion FOXO1 may taken part in the developing of DR,these found may provide an potential therapy target for DR.

Diabeticretinopathy；ForkheadboxtranscriptionfactorO1

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0206

寧夏自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (NZ14238)

寧夏銀川市第一人民醫(yī)院眼科，寧夏 銀川 750001

高春蘭(1974-)，女，副主任醫(yī)師，碩士學(xué)位，從事眼科基礎(chǔ)研究及臨床工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.008.html

R543

A

2016-06-20 [責(zé)任編輯]王凱榮