劉雅妮，陳 雪，莊文娟

·論 著·

先天性靜止性夜盲家系和無色素性視網(wǎng)膜色素變性家系臨床表型及突變基因的研究

劉雅妮1,2，陳 雪3，莊文娟1,2

目的 研究先天性靜止性夜盲家系和無色素性視網(wǎng)膜色素變性家系的致病基因突變及臨床表型特征。方法 收集在寧夏眼科醫(yī)院就診的1個(gè)先天性靜止性夜盲(CSNB)和1個(gè)無色素性視網(wǎng)膜色素變性(RPSP)家系的臨床資料，抽取患者家庭成員及其正常對(duì)照者外周靜脈血，提取DNA；運(yùn)用外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序芯片進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析后得到候選致病性突變位點(diǎn)。運(yùn)用PCR和直接測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，確定致病性突變位點(diǎn)。結(jié)果 CSNB 家系有3例患者，自幼夜盲，無進(jìn)行性加重，ERG表現(xiàn)為暗視ERG，即a波正常、b波顯著下降；EOG正常。RPSP家系有3例患者，自幼夜盲，逐漸加重。ERG檢查與暗視ERG，a波、b波均重度下降；EOG顯示光峰/暗谷明顯降低。通過基因檢測(cè)和生物信息分析，證實(shí)TRPM1基因p.R1025L為該家系的致病基因突變，MERTK基因p.R1443W為RPSP家系的致病基因突變。結(jié)論 先天性靜止性夜盲及無色素性視網(wǎng)膜色素變性根據(jù)眼底表現(xiàn)難以鑒別，ERG、EOG檢查及結(jié)合基因突變檢測(cè)分析，可為臨床診斷提供可靠依據(jù)。

先天性靜止性夜盲；無色素性視網(wǎng)膜色素變性；TRMP1；MERTK

先天性靜止性夜盲(CSNB)是一種少見的具有遺傳性的、非進(jìn)展性的視網(wǎng)膜病變。臨床特點(diǎn)為先天性的非進(jìn)行性夜盲，主要以視桿細(xì)胞的功能異常，從而導(dǎo)致夜視力受損，而明視覺通常并無明顯異常為特征，伴有或者不伴有斜視、屈光不正和眼球震顫等臨床表現(xiàn)，其暗適應(yīng)及視網(wǎng)膜電圖(ERG)發(fā)生特征性的改變[1]。無色素性視網(wǎng)膜色素變性(RPSP)患者眼底的表現(xiàn)除無典型性骨細(xì)胞樣色素沉著以外，其眼底表現(xiàn)與典型性視網(wǎng)膜色素變性相同，即視網(wǎng)膜色污濁、動(dòng)靜脈血管均變細(xì)、視盤顏色蠟黃等；眼底熒光素血管造影表現(xiàn)為彌散性椒鹽狀透見熒光，未見骨細(xì)胞樣遮蔽熒光[2]。CSNB 和RPSP雖都有夜視力障礙，由于臨床癥狀輕微或患者在現(xiàn)代人工照明的夜環(huán)境中，沒有意識(shí)到夜盲癥狀；患者就診時(shí)，如無夜盲主訴，臨床醫(yī)生不做電生理檢查，常常漏診或者誤診。而CSNB與RPSP疾病的遠(yuǎn)期癥狀，轉(zhuǎn)歸明顯不同。本文收集的CSNB與RPSP家系臨床資料，結(jié)合突變基因檢測(cè)，研究CSNB與RPSP家系的致病基因突變及臨床表型特征。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2014 年就診于寧夏眼科醫(yī)院的1個(gè)CSNB家系及 1個(gè)RPSP家系患者作為研究對(duì)象。所有患者及其家庭正常成員均進(jìn)行全面的眼科檢查，包括最佳矯正視力、視野、眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)、全視野視網(wǎng)膜電流圖(ERG)及眼電圖(EOG)檢查；記錄患者的家族史、婚育史及全身其他疾病史，確定遺傳方式。正常對(duì)照組為200例無血緣關(guān)系的正常健康成年人，年齡均>60歲，除患有輕度的年齡相關(guān)性白內(nèi)障外無其他眼科疾病。根據(jù)赫爾辛基宣言，所有研究對(duì)象均簽署由本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提?。翰杉庵芸鼓? mL，利用Qiamp Blood試劑盒(德國QIAGEN公司)提取全基因組DNA。DNA濃度≥50 mg/L，純度OD 260/280為1.8～2.0，DNA總量≥6 μg。

1.2.2 外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序：運(yùn)用外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序芯片技術(shù)，從每個(gè)家系選取的先證者和1名家庭正常人員進(jìn)行目前已知的189個(gè)視網(wǎng)膜疾病的相關(guān)基因進(jìn)行排查。該芯片是由羅

氏NimbleGen公司基于HD2平臺(tái)2.1 M外顯子序列捕獲微陣列芯片設(shè)計(jì)，包含179個(gè)和視網(wǎng)膜疾病相關(guān)的基因及U4/U6-U5三個(gè)小核糖核蛋白復(fù)合體中與編碼前體RNA剪切相關(guān)的10個(gè)基因。該芯片共包含4 641個(gè)外顯子，利用Nimble Gen外顯子捕獲系統(tǒng)和Illuminated Hiseq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序(BGI，華大基因研究院)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)包括基本數(shù)據(jù)和生物信息分析，檢測(cè)結(jié)果優(yōu)先關(guān)注其編碼區(qū)位點(diǎn)，并結(jié)合遺傳方式確定候選致病性的突變位點(diǎn)。運(yùn)用PCR及直接測(cè)序方法在家系其他人員和正常對(duì)照組中進(jìn)行驗(yàn)證，最終確定致病性的突變位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2個(gè)家系共收集到患者6例(圖1)，正常家庭成員4名。

圖1 兩種家系圖譜

2.1 CSNB家系：3例患者均為女性，患者視野及EOG檢查均正常。先證者就診時(shí)自訴自幼夜盲，無進(jìn)行性加重，色覺正常，屈光狀態(tài)(表1)，眼底表現(xiàn)為豹紋狀眼底改變，視盤顳側(cè)萎縮弧，黃斑區(qū)結(jié)構(gòu)未見異常(圖2，目錄后)。ERG檢查：暗適應(yīng)0.01 ERGb波呈熄滅型； 暗視3.0 ERG：a波、b波重度下降；明視3.0 ERG:a波和b波重度下降(表2)。先證者其大姐眼底基本正常，黃斑中心凹厚度右眼219 μm、左眼197 μm。先證者其二姐眼底表現(xiàn)豹紋狀眼底改變，視盤顳側(cè)萎縮弧，黃斑中心凹厚度為右眼206 μm、左眼237 μm。

表1 CSNB和RPSP家系6名患者臨床資料

2.2 RPSP家系：3例患者也均為女性。先證者自訴自幼夜盲，逐漸加重，白天視力明顯下降，色覺檢查為藍(lán)色盲，屈光狀態(tài)(表1)；眼底表現(xiàn)為視盤色偏白，血管細(xì)，黃斑區(qū)神經(jīng)上皮層萎縮、橢圓體帶消失，周邊網(wǎng)膜可見少量骨細(xì)胞樣色素沉著(圖3，目錄后)。ERG檢查：暗適應(yīng)0.01 ERGb波呈熄滅型； 暗視3.0 ERG：a波、b波重度下降；明視3.0 ERG:a波和b波重度下降；EOG：光峰/暗谷明顯降低。其妹主訴自幼夜盲，且逐漸加重，白天視力明顯下降，色覺檢查為全色盲，眼底表現(xiàn)為視盤色可，血管細(xì)，黃斑區(qū)神經(jīng)上皮層萎縮、橢圓體帶消失，黃斑中心凹厚度右眼130 μm、左眼138 μm。其姐主訴自幼夜盲，且逐漸加重，白天視力明顯下降，色覺檢查為藍(lán)色盲，眼底表現(xiàn)為視盤色白，血管細(xì)，黃斑區(qū)神經(jīng)上皮層萎縮、橢圓體帶消失，黃斑中心凹厚度右眼133 μm、左眼129 μm。3例患者后極部均未見骨細(xì)胞，周邊網(wǎng)膜可見少量骨細(xì)胞樣色素沉著。

表2 CSNB家系先證者ERG結(jié)果

2.3 致病基因突變分析：利用外顯子&目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序芯片、PCR和直接測(cè)序的方法以及生物信息分析，同時(shí)結(jié)合遺傳方式和患病特點(diǎn)，最終確定TRPM1基因p.R1025L為CSNB家系家系的致病基因突變，MERTK基因p.R1443W為RPSP家系的致病基因突變(基因改變)，見表3。

表3 CSNB和RPSP家系外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域測(cè)序結(jié)果

3 討論

CSNB與RPSP均屬遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良性疾病，臨床特點(diǎn)都有夜盲、白晝視力正?；蛳陆担曇爱惓?，眼底周邊視網(wǎng)膜無或僅有極少色素沉著。二者均有共同的致病基因，即RHO、PDE6B、SAG，但其ERG及EOG明顯不同：CSNB暗視ERGa波正常或接近正常，b波顯著下降甚至消失，b波和a波的振幅比<1；EOG正常。RPSP 暗視ERG：a波、b波振幅均下降或消失；EOG：光峰/暗谷明顯降低或消失，其致病基因也有差異。

CSNB，國內(nèi)相關(guān)報(bào)道較少。由于相當(dāng)部分患者無夜盲主訴使得CSNB患者易漏診或誤診，這和患者缺少特異性臨床癥狀、眼底視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常有關(guān)。CSNB這一疾病具有遺傳異質(zhì)性，患者均自幼發(fā)病，白晝視力正常，夜盲癥狀無進(jìn)展。根據(jù)孟德爾遺傳方式，可以將CSNB分為常染色體顯性遺傳型(AD 型)，常染色體隱性遺傳型(AR 型)及性連鎖隱性遺傳型(XL 型)。不同遺傳方式的CSNB臨床表現(xiàn)具有一定差異，但其功能上均主要以視桿系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征；AD型的患者其視力大多為正常，而明適應(yīng)、視野、色覺正?；蜉p度異常，不合并近視的癥狀。AR型及XL型的患者通常伴有近視，同時(shí)也可以合并視盤斜視或眼球震顫。AR 型的患者其矯正視力大多為0.2～0.5，而XL型的患者甚至?xí)霈F(xiàn)豹紋狀眼底、視盤傾斜及視盤周邊萎縮弧，這一型的患者最佳矯正視力通常為0.4～0.5，也可以到0.1～0.8。視覺電生理的檢查是CSNB診斷及分型的重要依據(jù)，根據(jù)ERG的改變，可將CSNB分為兩種類型，即Schubert-Bornschein型(負(fù)相型)及Riggs型。Schubert-Bornschein型患者其暗視白光ERG中的a波正?；蛘呓咏＃鴅 波的振幅表現(xiàn)為顯著下降或消失，同時(shí)b波及a波的振幅比<1，所以將其又稱為負(fù)相波。根據(jù)其ERG的改變可以推測(cè)出其病變的部位，在視網(wǎng)膜的雙極細(xì)胞區(qū)域并靠近外叢狀層，這一型的患者其眼電圖(EOG)表現(xiàn)為正常。本文收集的CSNB患者均有自幼夜盲、無明顯加重的主訴，其中2例表現(xiàn)為中高度近視，眼底表現(xiàn)為豹紋狀眼底、視盤傾斜及視盤周圍萎縮弧；1例為低度近視，3例矯正視力均明顯低于正常視力，為0.3～0.6，符合文獻(xiàn)報(bào)道的AR型患者的臨床表型。先證者ERG表現(xiàn)為暗視ERG，即a波正常、b波顯著下降，b波和a波的振幅比<1；EOG正常，表現(xiàn)為典型Schubert-Bornschein 型(負(fù)相型)，該家系診斷為CSNB，診斷明確，同時(shí)基因的檢測(cè)TRPM1基因p.R1025L的改變也驗(yàn)證了該診斷的正確性。目前為止，已有15個(gè)基因和CSNB有關(guān)(https://sph.uth.edu/RetNet/)，AR 型CSNB非常少見，TRPM1基因改變可以引起ARCSNB。TRPM1 屬于瞬時(shí)性感受器電位(TRP)通路家族的成員，該基因可改變視網(wǎng)膜ON 雙極細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的Ca2+水平，從而在視網(wǎng)膜神經(jīng)傳遞中起作用[3]。由TRPM1基因改變引起的CSNB疾病在國內(nèi)未見報(bào)道。近年來，莊樹林等[4 ]對(duì)中國人群一ADCSNB大家系進(jìn)行了研究，但均未發(fā)現(xiàn)任何突變。而王鳳羽[5]等發(fā)現(xiàn)的RHO基因Thr94Ile突變?yōu)閲鴥?nèi)首次報(bào)道。在該家系患者的RHO基因中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)C.281C>T的雜合錯(cuò)義點(diǎn)突變，該突變?cè)诘鞍踪|(zhì)水平將導(dǎo)致P.Thr94Ile的改變。睢瑞芳等[6]對(duì)X連鎖CSNB家系研究，發(fā)現(xiàn)家族中所有患者NYX基因外顯子2發(fā)生了錯(cuò)義突變，核苷酸772位的腺嘌呤被胞嘧啶取代(A772c)，對(duì)應(yīng)的蘇氨酸改變?yōu)楦彼?T258P)。

相對(duì)于CSNB的RP研究較為成熟。本文收集RPSP患者均自幼夜盲，逐漸加重，白天視力明顯下降，色覺檢查為藍(lán)色盲，眼底表現(xiàn)除無明顯骨細(xì)胞樣色素沉著外表現(xiàn)為典型的RP眼底改變：視盤色白，血管細(xì)，黃斑區(qū)色素上皮層萎縮、橢圓體區(qū)消失；先證者ERG檢查：暗適應(yīng)0.01 ERGb波呈熄滅型； 暗視3.0 ERG：a波、b波均重度下降；明視3.0 ERG：a波和b波重度下降；EOG：光峰/暗谷明顯降低。該家系診斷RPSP明確，外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序檢測(cè)出MERTK基因p.R1443W改變?yōu)樵摷蚁档闹虏』颉?992年以來，研究已發(fā)現(xiàn)的ARRP致病突變達(dá)30余種。仍有大量的ARRP患者不能明確致病基因[7]，MERTK基因位于2q 14.1，在RPE細(xì)胞中表達(dá)，參與RPE細(xì)胞吞噬視網(wǎng)膜外節(jié)膜盤的過程，其改變導(dǎo)致RPE吞噬通路的破壞[8]。歐美國家人群中，MERTK基因突變的頻率為1%左右[9]，MERTK基因的研究也為目前RP基因研究的熱點(diǎn)；韓菲[10]對(duì)在北京協(xié)和醫(yī)院收集的110例ARRP/SRP進(jìn)行基因研究，結(jié)果顯示MERTK基因突變率為6.9%，共發(fā)現(xiàn)18種致病突變，1種錯(cuò)義突變，1種無義突變，6種移碼突變，3種己報(bào)道，其中225delA，Gly76Glu，fsX3這一移碼突變?cè)?例患者6個(gè)DNA單倍體中出現(xiàn)，突變率較高。2例單眼發(fā)病的RP患者均存在MERTK基因突變。朱曉青[11]對(duì)收集的277例RP患者研究發(fā)現(xiàn)，MERTK基因在國人的致病率為1.6%，其發(fā)現(xiàn)的致病性突變?yōu)椋篶.225 DelA(p.Gly76GlufsX3)；c.797A>G(p.Asn266Ser)；c.1282A>G(p.Ser428Gly)；c.1669C>T(P.Arg557Trp。)

CSNB及RPSP雖從主訴及眼底表現(xiàn)難以鑒別，但依靠ERG及EOG可明確診斷，同時(shí)基因檢測(cè)可也為臨床診斷提供可靠依據(jù)。本研究應(yīng)用的外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域測(cè)序方法是一種利用特制的探針，針對(duì)特定的蛋白編碼區(qū)域DNA 或者特定的序列進(jìn)行捕獲，富集后進(jìn)行高通量測(cè)序，具有高效率、低成本、短耗時(shí)的特點(diǎn)。本研究中收集到的兩個(gè)家系均為隱性遺傳疾病，理論上相應(yīng)的基因突變檢測(cè)中可為一個(gè)純和突變，或者為兩個(gè)同時(shí)出現(xiàn)的雜合突變。但是就本研究中家系而言，目前我們的基因芯片檢測(cè)結(jié)果為可能致病的基因突變僅有一個(gè)位點(diǎn)，推測(cè)其原因?yàn)楹芏嘌劭葡嚓P(guān)疾病可遵循生殖細(xì)胞嵌合這種遺傳模式，也有很多致病基因可以同時(shí)遵循顯性遺傳和隱性遺傳兩種遺傳模式。為了更加全面地進(jìn)行遺傳學(xué)研究，其后我們將會(huì)輔助全外顯子組測(cè)序及功能實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步明確這兩個(gè)家系的致病突變。

本課題靠外顯子結(jié)合目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序檢測(cè)出TRPM1基因的改變?yōu)镃SNB的致病基因，豐富了國人的基因庫；而MERTK基因雖國內(nèi)已有報(bào)道，但目前已有應(yīng)用基因替代療法治療MERTK基因突變引起的視網(wǎng)膜色素變性(RP)，期待我們的研究為該家系患者提供幫助。

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Studies the clinical phenotypes and mutation disease-causing geness of congenital stationary night blindness pedigree and retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree

LIUYani1,2，CHENXue3，ZHUANGWenjuan1,2.

1.NingxiaEyeHospital,Ningxiapeople’sHospital,Yinchuan750002,China;2.TheFirstClinicalMedicalCollegeofNorthwestUniversityforNationalities,Yinchuan750002,China;3.DepartmentofOphtalmology,Jiangsupeople’sHospital,Nanjing210029,China

ZHUANGWenjuan,Email:zh-weng@163.com

Objective To study the disease-causing genes and clinical phenotypes of the congenital stationary night blindness pedigree and retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree.Methods One congenital stationary night blindness pedigree and one retinitis pigmentosa sine pigmento pedigree were recruited for this study.All the patients and family members received complete ophthalmic examinations.DNA was abstracted from patients，family members and controls.Using exon combined target region capture sequencing chip to screen the candidate disease-causing mutations.Polymerase chain reaction(PCR)and direct sequencing were used to confirm the disease-causing mutations.Results 3 patients in the congenital stationary night blindness pedigree are nonprogressive blindness.ERG shows a normal a-wave but a striking reduction of the b-wave on the dark-adapted bright flash ERG，whose amplitude of the b-wave is smaller than that of the a-wave and responses to a single bright flash in the Schubert-Bornschein type of ERG pattern but a normal responses to EOG.3 patients of the Retinitis pigmentosa sine pigmento pedigrees are progressive nyctalopia blindness from an early age.ERG shows a striking reduction of both a-wave and b-wave on the dark-adapted bright flash ERG.p.R1025L heterozygous missense mutation on TRPM1 gene in congenital stationary night blindness patients was detected.p.R1443W heterozygous missense mutation on MERTK gene in RPSP patients was detected by means of genetic tests and bio-information analysis.Conclusions Congenital stationary night blindness and Retinitis pigmentosa sine pigmento is difficult to identify according to fundus appearance，ERG，EOG examination combined with gene mutation detection and analysis can provide a reliable basis for clinical diagnose.

CSNB；RPSP；TRMP1；MERTK

10.13621/j.1001-5949.2017.03.0196

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460093)

1.寧夏人民醫(yī)院眼科醫(yī)院,寧夏 銀川 750002 2.西北民族大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 寧夏 銀川 750002 3.江蘇省人民醫(yī)院眼科,江蘇 南京 210029

劉雅妮(1979-)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生，從事眼科學(xué)臨床及遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)研究工作。

莊文娟：Email:zh-weng@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170313.0934.002.html

R774

A

2016-07-18 [責(zé)任編輯]王凱榮