黃湘吉，楊友才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

鎘脅迫對(duì)兩種芒屬植物葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響

黃湘吉，楊友才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

以芒屬植物A0104和C0424兩個(gè)品種的幼苗為材料，采用水培的方式探討了Cd脅迫對(duì)芒屬植物葉片抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：當(dāng)Cd濃度為1～2 mg/L時(shí)，Cd脅迫對(duì)C0424的影響較小，當(dāng)Cd濃度增加至3～4 mg/L時(shí)，C0424體內(nèi)氧化應(yīng)激加??；而A0104在1～4 mg/L的Cd脅迫濃度下均發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。這表明C0424在Cd耐性方面優(yōu)于A0104。

Cd脅迫；抗氧化系統(tǒng)；芒屬植物

土壤是人類賴以生存的自然資源，也是人類生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。隨著社會(huì)的進(jìn)步，在工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中，重金屬的使用越來(lái)越頻繁，使用后的重金屬得不到有效的處理，隨意排放到環(huán)境中，大氣、土壤和地表水中的重金屬通過(guò)植物的富集再由食物鏈進(jìn)入到人體內(nèi)，會(huì)對(duì)身體造成不良影響，甚至威脅到人類的健康。因此，土壤重金屬污染成為現(xiàn)階段農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最為突出的問(wèn)題之一[1]。重金屬在土壤中的形態(tài)變化復(fù)雜，常用的傳統(tǒng)修復(fù)方法可分為3大類：物理方法、化學(xué)方法和生物方法。其中，生物方法中的植物修復(fù)技術(shù)是目前研究的熱點(diǎn)。植物修復(fù)技術(shù)就是指利用對(duì)重金屬富集能力較強(qiáng)的植物吸收土壤中的重金屬污染物，然后將其轉(zhuǎn)移到植物地上部分，從而達(dá)到去除和降低土壤中重金屬含量的目的[2]。研究表明，芒屬植物能在鹽堿地中生長(zhǎng)，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的抗逆性[3]；已有報(bào)道稱芒屬植物中的五節(jié)芒對(duì)鉛、鋅等金屬有較好的耐性和積累作用；同時(shí)，芒屬植物的生物量很高。因此，芒屬植物在重金屬污染土壤修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。

為了探討不同濃度的Cd脅迫對(duì)芒屬植物苗期生理生化指標(biāo)的影響以及不同品種的芒屬植物對(duì)Cd的積累特征，選用A0104和C0424兩個(gè)品種作為對(duì)比，采用水培人為添加Cd的方式，培養(yǎng)30 d，測(cè)定各處理葉片POD、SOD、CAT的活性和MDA含量，進(jìn)而分析Cd脅迫對(duì)這兩種芒屬植物生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為芒屬植物A0104和C0424幼苗（株高5 cm左右，3片真葉），由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃提供。

主要試驗(yàn)試劑有硝酸、高氯酸、磷酸緩沖液、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫、三氯乙酸、Met溶液、NBT溶液、EDTA-Na2溶液、核黃素溶液和Cd標(biāo)準(zhǔn)溶液；主要試驗(yàn)設(shè)備有烘箱、恒溫水浴、制冰機(jī)、離心機(jī)、分光光度計(jì)、熒光燈、粉碎機(jī)、消解儀和ICPE-9000金屬原子檢測(cè)儀等；還有實(shí)驗(yàn)室常用器材，如消解管、移液槍、移液管、容量瓶、燒杯、研缽、量筒、試管、指形管、小藥瓶和離心管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將供試材料移栽到漂浮盆中，移栽完畢后，澆一次水，并向水中添加霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。待幼苗正常生長(zhǎng)10 d后，向培養(yǎng)液中添加Cd（以硝酸鎘的形式添加），使培養(yǎng)液中Cd濃度分別為0、1、2、3、4 mg/L，分別編號(hào)為CK、T1、T2、T3和T4處理。培養(yǎng)30 d后取樣，期間定時(shí)補(bǔ)充水分，保持培養(yǎng)液中Cd濃度不變。

1.2.2 SOD的測(cè)定 取0.5 g樣品清洗干凈，置于預(yù)冷的研缽，加入1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，倒入離心管，在4℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液為酶提取液。取5 mL指形管4支，2支測(cè)定管，2支對(duì)照管，加入酶提取液（對(duì)照管加等量緩沖液），將1支對(duì)照管暗處理，其他管至于4 000 Lx熒光燈下反應(yīng)20 min，在560 nm處測(cè)定吸光度。

式中，ACK為對(duì)照管（照光）的吸光度；AE為樣品管的吸光度；V為加入PBS的體積（mL）；Vt為測(cè)定時(shí)酶液的用量（mL）；W為樣品重量（g）。

1.2.3 POD的測(cè)定 取酶提取液0.1 mL加入磷酸緩沖液（0.05 mol/L）2.9 mL、2%H2O21 mL、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1 mL，用加熱煮沸5 min的酶提取液作為對(duì)照。置于37℃的水浴中反應(yīng)15 min，然后轉(zhuǎn)入冰浴，加入20%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，在470 nm處測(cè)定吸光度。

式中，ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品重量（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；VT為酶提取液總體積（mL）；VS為測(cè)定時(shí)取用的酶液體積（mL）。1.2.4 CAT的測(cè)定 取10 mL試管3支，分別加入0.2 mL酶提取液，然后加入磷酸緩沖液1.5 mL及蒸餾水1 mL，對(duì)照組在沸水浴煮沸1 min。然后向每個(gè)試管加入0.3 mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一次立即計(jì)時(shí)，馬上在240 nm處測(cè)定其吸光度，每隔1 min讀數(shù)1次，共測(cè)4 min。

式中，ΔA240為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化；W為樣品重量（g）；t為反應(yīng)時(shí)間（min）；VT為提取酶液總體積（mL）；VS為測(cè)定時(shí)取用酶液體積（mL）。

1.2.5 MDA含量的測(cè)定 取葉片樣品0.2 g加入1.6 mL10% TCA研磨成漿，倒入離心管在12 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL 0.67% TBA，在沸水浴煮30 min，冷卻后離心，取上清液分別在450、532、600 nm處測(cè)吸光度[4]。

MDA濃度C(μmol/L)=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

MDA含量（μmol/g FW）=C×V/W

式中，V為提取液的體積（L），W為樣品重量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素ANOVA法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd脅迫對(duì)芒屬植物葉片SOD活性的影響

從圖1中可以看出，隨著Cd濃度的升高，A0104葉片中SOD活性呈逐步上升的趨勢(shì)，T4處理的葉片SOD活性達(dá)到最高值，約為CK的1.7倍。與A0104品種不同，C0424在T1和T2處理時(shí)，葉片SOD活性隨Cd濃度的升高而降低，隨后在T3、T4處理出現(xiàn)反彈，葉片SOD活性急劇升高，T4處理的葉片SOD活性最高，約為對(duì)照的1.5倍。

圖1 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片SOD活性

2.2 Cd脅迫對(duì)芒屬植物葉片POD活性的影響

如圖2所示，兩個(gè)品種葉片的POD活性均隨Cd濃度的增加而上升，T1處理的POD活性上升程度較輕，A0104和C0424分別比對(duì)照升高了29%和23%，當(dāng)Cd濃度增加至4 mg/L（T4處理）時(shí)，A0104和C0424品種的POD活性分別是對(duì)照的2.6和1.5倍。

2.3 Cd脅迫對(duì)芒屬植物葉片CAT活性的影響

如圖3所示，不同Cd濃度處理對(duì)A0104和C0424葉片的CAT活性均有一定影響。隨著Cd處理濃度的升高，A0104葉片中CAT活性呈下降趨勢(shì)，當(dāng)Cd濃度為2 mg/L時(shí)，葉片CAT活性下降率為10.62%，下降程度較輕；當(dāng)Cd濃度上升至4 mg/L時(shí)，葉片CAT活性急劇下降，比對(duì)照下降了35.16%。而在C0424品種中，T1～T2處理的葉片CAT活性比對(duì)照有所提升，其中T2處理的CAT活性上升了26.57%；但當(dāng)Cd濃度增加至3～4 mg/L（T3～T4處理）時(shí)，葉片中CAT活性明顯降低，其中T4處理的葉片CAT活性與對(duì)照下降了26.83%。

圖2 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片POD活性

圖3 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片POD活性

2.4 Cd脅迫對(duì)芒屬植物葉片MDA含量的影響

從圖4中可以看出，隨著Cd濃度的升高，A0104品種葉片中MDA含量也隨之增加，葉片膜脂過(guò)氧化的程度隨之加深，T4處理的葉片MDA含量約為對(duì)照的2.1倍；與A0104相同，C0424品種葉片中MDA含量也隨環(huán)境中Cd脅迫濃度的升高而增加，T4處理的葉片MDA含量約為對(duì)照的1.7倍；但C0424葉片中MDA含量均低于A0104，除T3處理外，其他處理兩者之間MDA含量差異顯著。

圖4 不同濃度Cd處理下A0104和C0424的葉片MDA含量

3 結(jié)論與討論

植物能夠在一定的Cd脅迫范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)，同時(shí)積累一定量的Cd。植株抗氧化系統(tǒng)在清除活性氧、維持膜系統(tǒng)穩(wěn)定中起到了非常重要的作用。隨著環(huán)境中Cd脅迫的逐漸加重，會(huì)導(dǎo)致植物MDA含量的增加，從而加深膜脂過(guò)氧化的程度，進(jìn)而抑制植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[5]。

SOD存在于細(xì)胞的各組成部分中，它能夠消除新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)[6]。試驗(yàn)結(jié)果表明，A0104葉片中SOD活性隨Cd脅迫濃度的升高而增強(qiáng)，C0424則表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，在T1、T2處理時(shí)，C0424葉片SOD活性比對(duì)照低，說(shuō)明C0424對(duì)低濃度的Cd脅迫適應(yīng)性較強(qiáng)；當(dāng)Cd脅迫濃度上升至3～4 mg/L時(shí)，葉片SOD活性隨之增強(qiáng)，說(shuō)明Cd脅迫濃度大于2 mg/L（T2）后，C0424葉片開始產(chǎn)生大量的SOD用于解毒；兩個(gè)品種相比，C0424在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4個(gè)濃度中SOD活性均小于A0104。由此可知，在Cd濃度為1～4 mg/L時(shí)，C0424對(duì)Cd的耐性要高于A0104。

POD是細(xì)胞內(nèi)一種比較重要的抗氧化酶，細(xì)胞內(nèi)外的POD均能參與H2O2的清除[7]。在重金屬脅迫下，植物葉片的過(guò)氧化物酶活性表現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)[8]。同時(shí)，POD在衰老細(xì)胞中含量較高，也可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志之一。與前人的研究結(jié)果相似，A0104和C0424兩個(gè)品種葉片POD活性都隨著Cd脅迫濃度的升高而增強(qiáng)，說(shuō)明Cd脅迫加速了兩個(gè)品種葉片細(xì)胞的老化進(jìn)程。當(dāng)Cd濃度為1 mg/L時(shí)，A0104葉片POD活性低于C0424，說(shuō)明在該濃度下A0104葉片細(xì)胞衰老的速度低于C0424。當(dāng)Cd濃度增加至2～4 mg/L時(shí)，A0104葉片POD活性急劇升高，說(shuō)明高濃度（2～4 mg/L）的Cd脅迫加速了A0104品種葉片細(xì)胞衰老；而品種C0424的葉片POD活性則呈緩慢增強(qiáng)的趨勢(shì)，且低于A0104品種；這也說(shuō)明C0424較A0104對(duì)高濃度的Cd環(huán)境更具耐性。

過(guò)氧化氫酶（CAT）是催化過(guò)氧化氫分解成氧和水的酶，可以分解活性氧——羥基自由基，從而達(dá)到為機(jī)體解毒的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，A0104葉片CAT活性隨著Cd脅迫濃度的升高而減弱；而C0424則表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)Cd脅迫濃度為1～2 mg/L時(shí)，CAT活性高于對(duì)照，當(dāng)Cd脅迫濃度＞2 mg/L時(shí)，CAT活性減弱；在不同Cd脅迫濃度下C0424葉片的CAT活性均低于A0104。

丙二醛（MDA）含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度的體現(xiàn)。丙二醛含量高，說(shuō)明植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度高，細(xì)胞膜受到的傷害嚴(yán)重。在逆境環(huán)境下，植物會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化；當(dāng)植物體內(nèi)存在過(guò)剩的活性氧自由基時(shí)，也能發(fā)生膜脂過(guò)氧化[9]。Cd脅迫會(huì)使葉片細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化，隨著Cd脅迫濃度的升高，膜脂過(guò)氧化反應(yīng)加強(qiáng)，A0104和C0424都是如此。當(dāng)Cd脅迫濃度為3 mg/L時(shí)，兩個(gè)品種之間的MDA含量差異不顯著（P＞0.05）；其他濃度時(shí)，A0104葉片MDA含量均高于C0424，也就是說(shuō)A0104在Cd脅迫下葉片細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度高于C0424。

植物的抗氧化系統(tǒng)在防御外界脅迫時(shí)起到了至關(guān)重要的作用[10]?？偟膩?lái)講，C0424在Cd脅迫環(huán)境下的適應(yīng)性表現(xiàn)比A0104要好。在低濃度（1～2 mg/L）下，C0424基本上能夠適應(yīng)，SOD、POD值與對(duì)照差別不大，而CAT稍微高于對(duì)照，這說(shuō)明CAT在C0424適應(yīng)低濃度Cd環(huán)境中起到了重要的作用；而A0104則表現(xiàn)為另一種情況，當(dāng)Cd濃度為1～2 mg/L時(shí)，SOD、POD活性上升，與對(duì)照差異顯著，說(shuō)明低濃度的Cd對(duì)A0104品種造成了一定的危害，激活了植株體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)對(duì)抗外界的Cd脅迫；當(dāng)Cd濃度增加至3～4 mg/L時(shí)，C0424體內(nèi)SOD、POD活性急劇上升，CAT活性明顯降低，說(shuō)明高濃度的Cd抑制了C0424體內(nèi)的CAT活性，從而使植株無(wú)法及時(shí)清除體內(nèi)的活性氧自由基，導(dǎo)致SOD和POD活性的升高，氧化應(yīng)激加劇。因此，在芒屬植物苗期Cd耐性方面，C0424要優(yōu)于A0104。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Effects of Cadmium Stress on Antioxidant Enzyme System in Leaves of Two Species of Miscanthus

HUANG Xiang-ji，YANG You-cai

（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking seedlings of Miscanthus A0104 and C0424 as materials, the effects of Cd stress on the antioxidant enzyme system of the leaves of Miscanthus was studied by means of hydroponics. The results showed that 1-2 mg/L Cd have less effect on the C0424 Cd stress, but when the concentration of Cd increased to 3- 4 mg/L, Oxidative stress increased in C0424 oxidative stress. And strong oxidative stress reaction happened in A0104 under 1- 4 mg/L Cd stress concentrations. It was concluded that the tolerance to Cd in C0424 is stronger than that in A0104.

Cd stress; antioxidant system; Miscanthus

Q945.78

A

1006-060X（2017）04-0039-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.011

2016-12-13

湖南省農(nóng)業(yè)委員會(huì)2016年湖南重金屬污染耕地修復(fù)及農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)調(diào)整試點(diǎn)資金專項(xiàng)（湘財(cái)農(nóng)指〔2016〕130號(hào)）

黃湘吉（1989-），男，湖南張家界市人，碩士研究生，研究方向農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)。

楊友才