趙國欣，孫浩冉，姚 虹

(鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044)

液質聯(lián)用法測定不同形態(tài)丹參藥品中3種水溶性成分含量

趙國欣，孫浩冉，姚 虹

(鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044)

建立了同時測定不同形態(tài)丹參藥品中原兒茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸3種成分含量的超高效液相色譜-質譜聯(lián)用分析方法。采用Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱，以0.1%甲酸溶液-甲醇為流動相梯度洗脫，流速0.300 mL·min-1,柱溫為30℃。采用電噴霧離子源(ESI)，選擇反應離子檢測(SRM)模式。結果顯示，原兒茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸線性范圍均為0.10～1000ng·mL-1，檢測限為0.05 ng·mL-1。

液質聯(lián)用；原兒茶醛；丹酚酸B；迷迭香酸；選擇反應離子監(jiān)測

丹參又名赤參、紫丹參、紅根等，為唇形科植物，主要分布于四川、山西、河北、江蘇、安徽、河南等地。丹參的干燥根和根莖具有活血祛瘀、涼血消腫等功效，可用于心血管系統(tǒng)疾病的治療[1]。丹參的有效成分分為水溶性和脂溶性兩類。根據(jù)文獻報道，水溶性成分多為鄰苯二羥基類化合物，主要有丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸等[2-4]；脂溶性成分主要有隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、二氫丹參酮等[5-6]。

對于丹參成分的分析，涉及藥材、片劑、滴丸、針劑和口服液等[7-11]。目前測定方法主要有超高效液相色譜(UPLC)法[4]、高效液相色譜-二極管陣列檢測(HPLC-DAD)法[2，12]、快速液相色譜-串聯(lián)質譜(UFLC-MS/MS)法[13]以及超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法[14]。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜(UPLC-MS/MS)法同時檢測丹參中3種水溶性成分含量，可在5.1min內(nèi)完成一次色譜分析，操作簡便，線性范圍寬，分析方法快速、準確。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

UltiMate 3000 超高效液相色譜儀：美國Thermo公司；TSQ Quantum Access Max三重四級桿液質聯(lián)用儀：美國Thermo公司；Milli-Q system超純水儀：美國Millipore公司； XSE205DU半微量分析天平：瑞士Mettler Toledo公司；KQ-50B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 原料與試劑

對照品原兒茶醛(批號110810-201007)、丹酚酸B(批號111562-201313)：中國食品藥品檢定研究院提供；迷迭香酸(批號MUST-14020115)：成都曼思特生物科技有限公司提供；復方丹參片(國藥標準字 Z15020566)：內(nèi)蒙古仁澤藥業(yè)有限公司；復方丹參片(國藥標準字 Z44022225)：廣東一力集團制藥有限公司；復方丹參滴丸(國藥準字 Z1095011)：天士力制藥集團股份有限公司；丹參注射液(國藥準字 Z51021303)：四川升和藥業(yè)股份有限公司；甲醇、甲酸：色譜純，德國Merck公司；水為高純水(Millipore system)。

2 方法與結果

2.1 色譜-質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫條件見表1；流速0.300 mL·min-1,柱溫30℃,進樣量5 μL。

表1 洗脫梯度

2.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓：3kV；蒸汽壓溫度：400℃；鞘氣壓力：40psi；輔助氣壓力：10psi；毛細管(離子傳輸管)溫度：320℃。

檢測方式：選擇反應檢測(SRM)。各組分監(jiān)測離子對及相關參數(shù)設定見表2。

表2 質譜參數(shù)

注：*為定量離子。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液

準確稱取3種對照品各2.5 mg，分別用甲醇溶解，然后定容至25 mL，于4℃下冷凍保存。

分別精密量取上述對照品溶液1.0 mL，然后用甲醇定容至10 mL，制成濃度為10 μg·mL-1的混合標準溶液，于4℃下冷凍保存。

2.2.2 供試品溶液

準確稱取樣品1.0 g(固體樣品需去糖衣，研細)，分別用甲醇溶解，超聲10 min， 靜置放冷，用甲醇定容至100 mL，搖勻，用0.22 μm的濾膜過濾。取濾液，按一定比例稀釋。

2.3 檢測限和定量限的測定

分別取對照品儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋，按上述色譜-質譜條件進行測定。根據(jù)3倍和10倍信噪比計，測定檢出限和定量限，結果如下：原兒茶醛(LOD 0.05 ng·mL-1，LOQ 0.1 ng·mL-1)；丹酚酸B(LOD 0.05 ng·mL-1， LOQ 0.1 ng·mL-1)；迷迭香酸(LOD 0.05 ng·mL-1，LOQ 0.1 ng·mL-1)。

2.4 線性關系考察

精密量取混合對照品儲備液適量，用50%甲醇水溶液稀釋成0.1，0.2，0.5，1，5，10，50，100，500，1000 ng·mL-1系列濃度混合對照品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，進行UPLC-MS/MS分析，記錄色譜圖如圖1所示。

將上述系列混合對照品溶液分別按色譜-質譜條件進樣分析，以3種化合物的濃度為橫坐標，以檢出峰面積為縱坐標進行線性回歸。實驗結果見表3。

2.5 加樣回收率試驗

在100 μg·mL-1樣品中添加濃度相當于10 ng·mL-1，100 ng·mL-1，1000 ng·mL-1的高、中、低3種濃度混合對照品溶液，每個濃度溶液6份，測得回收率見表4。結果表明，各化學藥物回收率和精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一份供試品溶液，分別于0h，6h，12h，18h，24h進樣測定，結果顯示各成分的峰面積RSD分別為：原兒茶醛0.94%、丹酚酸B 1.2%、迷迭香酸0.75%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7 樣品測定

將上述分析方法用于各類丹參藥材3種成分的含量測定，結果見表5。不同種類制劑的丹參藥材中活性成分的含量存在明顯的差異。

3 討論

3.1 萃取條件的優(yōu)化

本文分別考察了甲醇、50%甲醇水溶液、乙腈等提取溶劑，結果發(fā)現(xiàn)采用甲醇和乙腈提取效果好。綜合考慮提取效率及成本，最終選擇甲醇為提取溶劑。

3.2 色譜分離條件

本文分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液(含5mmol·L-1乙酸銨)、乙腈-水等流動相體系，結果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相體系色譜分離情況最好。

4 結論

本文建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法可多組分同時檢測丹參藥品中有效成分含量，該方法專屬性強、靈敏度高、準確度好，檢測速度快。用該法同時測定不同形態(tài)丹參藥品中原兒茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸3種成分含量，采用Hypersil Gold C18(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)色譜柱，以0.1%甲酸溶液-甲醇為流動相梯度洗脫，流速0.300 mL·min-1，柱溫為30℃。采用電噴霧離子源(ESI)，選擇反應離子檢測(SRM)模式。結果顯示，原兒茶醛、丹酚酸B、迷迭香酸線性范圍均為0.10～1000ng·mL-1，檢測限為0.05 ng·mL-1。

圖1 3種對照品提取離子(定量)LC-MS圖譜

表3 3種化學藥物的回歸方程和相關系數(shù)

組分線性范圍/ng·mL-1回歸方程r原兒茶醛0.10-1000Y=-235.871+252.568*X0.9969丹酚酸B0.10-1000Y=-528.139+1009.03*X0.9987迷迭香酸0.10-1000Y=-16.5308+768.545*X0.9990

表4 3種化學藥物的加樣回收率(n=6)

表5 樣品測定結果

[1]王慕鄒，陳毓亨.常用中草藥高效液相色譜分析[M]. 北京:科學出版社，1999.

[2]王偉，張雪，褚文靜，等.高效液相二極管陣列檢測法同時測定丹參粉針劑中4種水溶性成分的含量 [J].中成藥,2011,33(2):266-269.

[3]趙靜，李玉琴，段瑞，等.高效液相色譜法測定百花丹參3種炮制品中5種酚酸類成分的含量[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(23):154-157.

[4]李耿，孟繁蘊，楊洪軍，等. UPLC法同時測定丹參中11種成分的含量 [J].中國藥房，2014,25(19):1766-1768.

[5]張琳琳，王淳，宋志前，等. HPLC 同時測定白花丹參中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和二氫丹參酮Ⅰ的含量[J].中國實驗方劑學雜志.2015,21(6):62-65.

[6]施超歐，陶萍.丹參注射液主要成分的HPLC及LC-MS定性分析 [J].世界科學技術, 2001(5):29-33.

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[13]Xu Y P,Huang K X,Pan Y,et al. A Rapid UFLC-MS/MS Method for Simutaneous Determination of Formononetin,Cryptotanshinone,Tanshinone IIA and Emodin in Rat Plasma and Its Application to a Pharmacokinetic Study of Bu Shen Huo Xue formula[J].Journal of Chromatography B,2013,932,92-99.

[14]趙國欣，劉萌，李領川,等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定中草藥丹參中7種成分含量[J].中國實驗方劑學雜志,2017,23(1):60-63.

(責任編輯 姚虹)

The Determination of Three Kinds of Water-soluble Components in Salvia Miltiorrhiza of Different Form by UPLC-MS/MS

ZHAO Guo-xin, SUN Hao-ran, YAO Hong

(College of Chemical Industry and Food, Zhengzhou Institute of Technology, Zhengzhou 450044, China)

A rapid analytic method for the simultaneous determination of protocatechualdehyde, salvianolic acid B and rosmarinic acid in salvia miltiorrhiza of different form was established by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS). The column was Hypersil Gold C18 (2.1mm×100mm，1.9μm) and the column temperature was set at 30℃. The mobile phase was consisted of 0.1% acetic acid and methanol with gradient elution and the flow rate was 0.300mL·min-1. Selective reaction monitoring (SRM) mode was used with electrospray ionization (ESI) source. The calibration curves of protocatechualdehyde, salvianolic acid B and rosmarinic acid were linear in the range of 0.10-1000ng·mL-1. The detection limits were 0.05 ng·mL-1.

UPLC-MS/MS; Protocatechualdehyde; Salvianolic Acid B; Rosmarinic Acid; SRM

2017-03-05

河南省重點科技公關項目(152102210016；152102310130)

趙國欣(1980—)，女，河南焦作人，碩士，鄭州工程技術學院化工食品學院講師，主要從事食品藥品儀器分析檢測研究。

10.13783/j.cnki.cn41-1275/g4.2017.02.024

R286.0

A

1008-3715(2017)02-0105-04