黎 英， 陳雪梅， 張 靈， 李文霞， 石小瓊

（龍巖學(xué)院 閩西食品研究所，福建 龍巖 364012）

復(fù)合酶法提取漳平水仙餅茶多糖的工藝優(yōu)化

黎 英， 陳雪梅， 張 靈， 李文霞， 石小瓊

（龍巖學(xué)院 閩西食品研究所，福建 龍巖 364012）

以漳平水仙餅茶為原料，多糖得率為指標(biāo)，先采用正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶最佳配比，進(jìn)而在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響多糖得率的顯著因素，再結(jié)合Design-Expert7.1.3軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析優(yōu)化。結(jié)果表明：果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶的最佳活力單位配比為：15∶10∶18；酶解pH對(duì)提取漳平水仙餅茶多糖達(dá)到極顯著效應(yīng)，加酶量、酶解溫度達(dá)到顯著水平；最佳工藝參數(shù)為液料體積質(zhì)量比為80 mL∶1 g，加酶量3.0%，酶解溫度49℃，酶解pH為6.0，酶解時(shí)間90 min，在此條件下，水仙餅茶多糖得率為4.26%。

水仙餅茶；多糖 ；復(fù)合酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法

Keywords：Shuixian Tea Cake，polysaccharides，complex enzymes，Plackett-Burman design，response surfaceanalysis

福建漳平水仙茶自元代開始種植，其茶梗粗壯，葉張肥厚，迄今種植面積約2萬畝，常年產(chǎn)量達(dá)2 500 t，并于2009年獲農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志登記證書。水仙茶餅又名“紙包茶”是烏龍茶中唯一的壓緊茶，其制作工藝獨(dú)特（木模壓制成方形后用紙包固定，焙干成形），于國(guó)內(nèi)屬首創(chuàng)，產(chǎn)品外形見方扁平，經(jīng)久藏，耐沖泡，色澤烏褐油潤(rùn)，滋味醇厚，香氣清高[1-5]。

茶多糖是一種酸性糖蛋白高分子化合物，研究表明茶多糖除具植物多糖的藥理活性特性如抗輻射、降血糖等功效外，還在增強(qiáng)人體非特異性免疫功能及減慢心率方面起明顯作用[6-8]，但關(guān)于水仙餅茶多糖的提取工藝的研究尚未見報(bào)道。作者利用纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶作用條件溫和，能高效降解細(xì)胞壁、細(xì)胞間的果膠質(zhì)和水解蛋白質(zhì)，使細(xì)胞中目標(biāo)分離物充分、快速?gòu)慕M織內(nèi)分離出來，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)和活性影響小等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到高效提取水仙餅茶多糖的目的[9-11]。通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響水仙餅茶多糖得率的主要因素，用中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)主要因素進(jìn)行優(yōu)化[12-18]，獲得水仙餅茶多糖最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

水仙餅茶：漳平九鵬茶葉有限公司提供；纖維素酶（1 800 U/mg）、果膠酶（1 000 U/mg）、木瓜蛋白酶（1 000 U/mg）：上海金穗生物科技有限公司；無水乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等所用試劑均為分析純：上海國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma化學(xué)公司產(chǎn)品；試驗(yàn)主要儀器為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE52AA型）：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；電子分析天平（TB-114型）：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)（TGL-16G-A型）：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；真空冷凍干燥機(jī) （FD-1-50型）：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)（UV-2102C型）：尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取5.015 mg經(jīng)105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水溶解，移入50 mL容量瓶并定溶，配制成質(zhì)量濃度為0.100 3mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于50 mL容量瓶并加蒸餾水至刻度，搖勻備用。移取上述系列溶液2 mL于6個(gè)25 mL具塞刻度試管中，各精密加入1.0 mL體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸溶液混勻，加蒸餾水定容，室溫下靜置30min。以0號(hào)管為空白對(duì)照，490nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。得線性回歸方程

y=6.897 2x-0.006 6，R2=0.999 5。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

1.2.2 水仙餅茶多糖得率的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取經(jīng)50℃烘至恒重、粉碎過60目篩的水仙餅茶粉5.0 g，按試驗(yàn)設(shè)定的條件加蒸餾水進(jìn)行酶提取處理，4 000 r/min離心10 min，真空抽濾，濾渣以同樣的條件再重復(fù)操作1次，合并濾液濃縮至1/4，加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，于4℃冷藏柜中靜置過夜，離心得沉淀，用無水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌2次，真空干燥后蒸餾水復(fù)溶定容至50mL。取定容后的水仙餅茶多糖樣品液2 mL于25 mL具塞刻度試管中，用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線得操作步驟測(cè)水仙餅茶多糖的吸光度值，重復(fù)3次，取平均值。按以下公式計(jì)算多糖得率。

式中，m為稱取的水仙餅茶干粉質(zhì)量，mg；y為吸光度值；V為樣品體積，mL。

1.2.3 復(fù)合酶配比試驗(yàn) 在150mL燒杯中各加入5.0 g水仙餅茶粉，加入100倍蒸餾水，用檸檬酸鈉和磷酸二氫鈉溶液調(diào)pH值至6.0，加入不同用量的果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行組合試驗(yàn)（見表3），于60℃，200 r/min恒溫?fù)u床中提取120 min后用冰水滅酶15min，抽濾除雜，測(cè)多糖。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。選擇提取效果最好的復(fù)合酶配比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 水仙餅茶總多糖得率的單因素試驗(yàn) 稱取水仙餅茶粉5.0 g，復(fù)合酶質(zhì)量比為15∶10∶18配比添加，在液料體積質(zhì)量比（20、40、60、80、100、120mL/g），加酶量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%），酶解溫度 （20、30、40、50、60、70℃），酶解pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0），酶解時(shí)間（30、60、90、120、150、180 min）的條件下提取。以水仙餅茶多糖得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 水仙餅茶總多糖得率的響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出來的對(duì)提取率影響顯著3個(gè)因素，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1）。R為多糖得率，%。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of central com posite design experiments for RSA

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶配比試驗(yàn)結(jié)果

從表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)水仙餅茶多糖得率影響最大的是木瓜蛋白酶，其次是果膠酶和纖維素酶。最佳工藝A3B2C2，即果膠酶3 000 U、木瓜蛋白酶2 000 U、纖維素酶3 600 U。由于A3B2C2不在所列正交試驗(yàn)表內(nèi)，按此組合平行進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖得率平均值為4.18%，高于其他組合，故后續(xù)試驗(yàn)復(fù)合酶活力單位配比均采用15∶10∶18。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 液料體積質(zhì)量比對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響 從圖2可以看出，當(dāng)液料體積質(zhì)量比小于80 mL/mg時(shí)，隨著液料體積質(zhì)量比的加大，水仙餅茶多糖得率不斷上升，當(dāng)液料體積質(zhì)量比大于80 mL/mg時(shí)，隨著蒸餾水用量的增加，多糖得率卻呈下降趨勢(shì)?？赡苁且?yàn)楫?dāng)蒸餾水加入量過少時(shí)，不利于水仙餅茶粉的充分溶解，提取效果不佳；而蒸餾水加入過量會(huì)不利于酶的水解反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致提取效果下降。綜合考慮溶劑用量、浸提效果和經(jīng)濟(jì)成本，確定液料體積質(zhì)量比80mL/mg時(shí)最佳條件。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

圖2 液料體積質(zhì)量比對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides from Shuixian Tea cake

2.2.2 加酶量對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響 在其他因素不變，持續(xù)增加復(fù)合酶用量的情況下，水仙餅茶多糖得率開始顯著提高，但加酶量達(dá)到3%后，多糖得率增加卻趨于平緩。這可能是由于復(fù)合酶能高效、快速使多糖化合物從細(xì)胞中分離出來，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著復(fù)合酶濃度上升，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)大增，多糖溶出量相應(yīng)增加；當(dāng)復(fù)合酶用量達(dá)到飽和后，由于一部分復(fù)合酶失去與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)，因此雖加大復(fù)合酶用量，但多糖得率增加并不明顯，還造成酶的浪費(fèi)。故確定加酶量以3%為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.3 酶解溫度對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響 在試驗(yàn)設(shè)定的酶解溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的升高，水仙餅茶多糖得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。原因可能是酶的活性受溫度影響較大，溫度較低時(shí)，酶的活性受到抑制，導(dǎo)致提取效果不佳；隨著溫度的上升，既加劇物質(zhì)分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，又使酶的活性逐漸增強(qiáng)，到最適溫度時(shí)，酶的活性達(dá)到最強(qiáng)，多糖得率相應(yīng)也達(dá)到最大值；超過最適溫度后，隨著溫度的升高，一方面酶的活性反而逐漸減弱，甚至失活，另一方面高溫也可能導(dǎo)致水仙餅茶多糖的結(jié)構(gòu)變化，故多糖得率反而下降。因此，酶解溫度設(shè)定為50℃。

2.2.4 酶解pH對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響 pH值對(duì)水仙餅茶多糖得率影響較顯著，可能與每種酶的最適pH值（果膠酶為2．5～6．0；木瓜蛋白酶為5～7；纖維素酶為4．0～5．5）有關(guān)，復(fù)合酶在偏酸性條件下復(fù)合酶活力最強(qiáng)，酸堿度過酸或過堿都會(huì)導(dǎo)致酶活性降低，從而影響多糖的提取。水仙餅茶多糖得率在pH值為5．0時(shí)效果最好。故選擇5．0為最佳酶解pH。

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響 水仙餅茶多糖得率隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)先明顯持續(xù)增大，當(dāng)酶解時(shí)間為90 min時(shí)，達(dá)最大值，而后隨酶解時(shí)間增加得率反而減小。這可能是由于開始時(shí)酶不能充分發(fā)揮其水解作用，隨后可能是因?yàn)樵陂L(zhǎng)時(shí)間加熱作用下，既會(huì)使水仙餅茶多糖的結(jié)構(gòu)改變，也會(huì)導(dǎo)致復(fù)合酶失活，故造成得率減小。因此，最佳酶解時(shí)間確定為90min。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及篩選關(guān)鍵因素結(jié)果

利用Minitab 15軟件對(duì)液料體積質(zhì)量比、加酶量、溫度、pH、時(shí)間等5個(gè)因素進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擬合和方差分析。

在5個(gè)影響多糖得率因素中，強(qiáng)弱依次排序?yàn)椋篨4（pH）＞X3（溫度）＞X2（加酶量）＞X5（時(shí)間）＞X1（液料體積質(zhì)量比）。其中酶解pH對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響達(dá)到極顯著水平，酶解溫度和加酶量的影響達(dá)到顯著水平，而液料體積質(zhì)量比和酶解時(shí)間則影響不顯著。因此選擇酶解pH、酶解溫度和加酶量這3個(gè)因素進(jìn)一步做響應(yīng)面優(yōu)化分析。液料體積質(zhì)量比和酶解時(shí)間這兩個(gè)因素根據(jù)其呈現(xiàn)的正負(fù)效應(yīng)和節(jié)約成本的原則，并結(jié)合單因素試驗(yàn)，將其固定在較好水平上，即液料體積質(zhì)量比為80mL/g，酶解時(shí)間90min進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 水仙餅茶多糖得率的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水仙餅茶多糖得率為分析指標(biāo)，采用Design-Expert7．1．3軟件中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)試驗(yàn)，建立數(shù)學(xué)模型，分析各因素之間的交互作用對(duì)結(jié)果的影響。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)自變量編碼A、B及C進(jìn)行分析，可得到相關(guān)回歸系數(shù)，其二次多項(xiàng)式方程為：

Y=-1．653 75+1．058 75*A+0．142 12*B+0．305 00*C-1．500 00×10-4*A*B+5．000 00×10-3*A*C-1．000 00× 10-3*B*C-0．176 25*A2-1．362 50×10-3*B2-0．023 750*C2

上述回歸模型P＜0．000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0．268 4＞0．05，影響不顯著，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，擬合程度良好，可用本試驗(yàn)所得的二次回歸方程對(duì)相應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)；同時(shí)其決定系數(shù)R2=0．995 9，校正決定系數(shù)R2=0．990 7，說明試驗(yàn)可靠性和精確度較好；另外變異系數(shù)CV=0．29%，也表明可以用該回歸方程對(duì)水仙餅茶多糖得率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。其中一次項(xiàng)C和二次項(xiàng)中的A2、B2、C2對(duì)多糖得率影響都極顯著（P＜0．01），A、B對(duì)R值得影響顯著（P＜0．05），交互項(xiàng)AB、AC、BC不顯著 （P＞0．05）。且A、B和C的顯著性結(jié)果和Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)中顯著性分析相一致。

從響應(yīng)曲面等值線的形狀接近橢圓形和曲面傾斜度較陡可看出，酶解pH值對(duì)水仙餅茶多糖得率的影響最為顯著，而酶解溫度和加酶量次之，表現(xiàn)為曲線較為平緩和等值線形狀接近圓形。利用Design-Expert7．1．3軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析獲得水仙餅茶多糖的最佳提取工藝條件。

2.5 優(yōu)化條件下水仙餅茶多糖得率的驗(yàn)證試驗(yàn)

按上述條件下進(jìn)行3次平行水仙餅茶多糖提取試驗(yàn)，所得水仙餅茶多糖得率分別為4．28%、4．25%、4．24%，平均為4．26%，RSD值為0．489%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近。

3 結(jié)語

1）提取水仙餅茶多糖所用的復(fù)合酶最佳配比：果膠酶3 000U、木瓜蛋白酶2 000U、纖維素酶3 600 U。影響強(qiáng)弱依次為：木瓜蛋白＞果膠酶＞纖維素酶。

2）在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman結(jié)合響應(yīng)面分析法，有效地從水仙餅茶多糖得率的5個(gè)影響因素中篩選出主要的影響因素，并實(shí)現(xiàn)條件優(yōu)化。獲得最佳提取條件參數(shù)為：液料體積質(zhì)量比為80 mL/g，加酶量3．0%，酶解溫度49℃，酶解pH為6．0，酶解時(shí)間90min，在此條件下，通過3次驗(yàn)證試驗(yàn)，水仙餅茶多糖得率平均為4．26%，與預(yù)測(cè)值（4．29%）的相對(duì)誤差為0．699%，差異不顯著。

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Optim ization of Enzymatic Extraction of Polysaccharides from Zhangping Shuixian Tea Cake Using Com p lex Enzymes

LIYing， CHEN Xuemei， ZHANG Ling， LIWenxia， SHIXiaoqiong
（M inxi Food Research Institute，Longyan University，Longyan 364012，China）

The enzymatic extraction of polysaccharides from Zhangping Shuixian Tea Cake by complex enzymeswas optim ized according to the yield of polysaccharide yield firstly by the L9（34）orthogonal experiments to determ ine the best ratio of complex enzymes.Five significant factors based on the single factor experimentwere further studied using Plackett-Burman design，including solid-liquid ratio，amount of complex enzymes，enzymatic hydrolysis temperature，pH value for enzyme hydrolysis，and enzymolysis duration. Furthermore，the main factors affecting polysaccharides yield were investigated and optim ized by Box-Behnken center-united experiment and RSM.The best ratio of complex enzymes for pectinase，papain and cellulase enzyme was determined as 15∶10∶18.The pH value of enzyme hydrolysis showed extremely significanteffecton polysaccharides extraction，while the amount of complex enzymes and enzymolysis duration significantly affect polysaccharides extraction.The optimum extraction condition was using 80∶1 of solid-liquid ratio（m L/g）and 3.0%of complex enzymesamountat49℃under pH 6.0 for90min，underwhich the yield of polysaccharideswas4.26%.

S 571.1

A

1673—1689（2017）04—0443—05

2015-05-21

福建省教育廳科研項(xiàng)目（JA13310）。

黎 英（1974—），女，福建長(zhǎng)汀人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品科學(xué)研究。E-mail：liying213fjly@163.com

黎英 ，陳雪梅，張靈，等.復(fù)合酶法提取漳平水仙餅茶多糖的工藝優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（04）：443-447.