周 穩(wěn)， 管政兵， 蔡宇杰， 趙 宏， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

芽胞漆酶的固定化方法對比研究與載體選擇

周 穩(wěn)1，2， 管政兵1，2， 蔡宇杰1，2， 趙 宏1，2， 廖祥儒*1，2

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

為了找到適合芽胞漆酶固定化的載體和方法，對12種載體共19種芽胞漆酶固定化方案進(jìn)行了對比研究，并通過參考固定化芽胞漆酶的酶活力回收率、重復(fù)利用率、成本等因素，選定以DEAE-纖維素為載體通過離子結(jié)合法固定為最佳方案。結(jié)果表明，包埋法固定化芽胞漆酶存在嚴(yán)重的擴(kuò)散限制作用，部分包埋法制備的微球還會伴有溶解、膨脹的現(xiàn)象。而多孔材料常因孔徑過小難以固定芽胞。芽胞以碳二亞胺為交聯(lián)劑與載體進(jìn)行共價結(jié)合，具有良好的固定化性能，可作為備選方案。

芽胞漆酶；包埋法；吸附法；離子結(jié)合；共價結(jié)合

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅多酚氧化酶，能夠利用O2作為電子受體催化多種酚類物質(zhì)氧化，在存在介體輔助的情況下，它還能夠催化非酚類物質(zhì)氧化[1]。漆酶由于其廣泛的底物譜和環(huán)境友好的特性，在廢水處理、生物修復(fù)、食品加工、生物傳感器、有機(jī)合成、木質(zhì)素降解處理中都極具應(yīng)用潛力。漆酶廣泛存在于高等植物、真菌、細(xì)菌和昆蟲之中。其中，真菌漆酶的研究報道最多，研究得最深入，然而因其漆酶活性對酸性環(huán)境的極度依賴而難以得到廣泛的工業(yè)化應(yīng)用[2]。細(xì)菌漆酶由于其極度耐高溫和耐堿的特性而成為近十年新的漆酶研究熱點(diǎn)。

芽胞漆酶（spore laccase），即固著在芽胞上的漆酶，是最具代表性的細(xì)菌漆酶，其活性來源于芽胞外衣蛋白[3]。芽胞除具漆酶活性外，其表面20余種外衣蛋白可能還具有過氧化氫酶、乙酰脫氫酶、核酮糖激酶等活性[4]。

固定化芽胞是一項極具意義的工作。其意義不僅在于芽胞漆酶的研究和應(yīng)用，更為芽胞的其他應(yīng)用提供了固定化的經(jīng)驗(yàn)。作者通過包埋、吸附和共價結(jié)合以及其復(fù)合方法對來源于Bacillus pumilus W3的芽胞進(jìn)行了固定化方法的對比研究，并從固定化芽胞的漆酶活力回收、形狀、溶解性、膨脹性、機(jī)械強(qiáng)度等方面評價了各種方法對芽胞漆酶的固定化性能，為芽胞的固定化載體和方法選擇提供了思路。此外，作者還首次提出了將PVA海綿作為載體應(yīng)用于酶或細(xì)胞固定化的技術(shù)方案。

1 材料與方法

1.1 試劑

丁香醛連氮（SGZ）、聚乙烯亞胺（PEI）、2，2-聯(lián)氮-二 （3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）（AR）：Sigma公司產(chǎn)品；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、活性炭（顆粒狀，C112235：催化劑載體專用）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）：阿拉丁試劑（上海）有限公司產(chǎn)品；PVA海綿（Saugwunder）：寧波海天集團(tuán)產(chǎn)品；樹脂D 113：安徽三星樹脂有限公司產(chǎn)品；樹脂HPD 300、HPD 400：滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品；DEAE-纖維素、戊二醛（GA）、聚乙烯醇（PVA）、海藻酸鈉（SA）、正硅酸四乙酯（TEOS）、硅藻土（celite 545）、聚乙二烯苯小球（GDX-101）、羥基磷灰石（HAP）等（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與芽胞準(zhǔn)備 將分離于五倍子蜂蜜樣品的菌株B.pumilus W3[5]接種于LB培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，然后按質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的接種量接入裝液量為100mL的三角瓶中，在30℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)48 h，芽胞大量生成。生胞培養(yǎng)基（DSM培養(yǎng)基）含營養(yǎng)肉湯 8 g/L、KCl 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、MnCl2·H2O 0.002 g/L。高壓滅菌后加入過濾除菌的CuSO4、CaCl2和FeSO4溶液并使其終濃度分別為0.2、0.5、0.005 mmol/L。芽胞懸液按王賀報道的方法進(jìn)行制備[6]。

1.2.2 酶活檢測 漆酶活性利用分光光度法進(jìn)行檢測。將0.1mL游離芽胞或具相同芽胞量的固定化芽胞加入到3.4 mL檸檬酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.8，0.1 mol/L），在37℃條件下保溫15 min，使酶的活性中心充分激活，然后加入SGZ（終濃度為 0.05 mmol/L）或ABTS（終濃度為0.5mmol/L），反應(yīng)5 min之后將反應(yīng)樣品進(jìn)行10min的冰水浴以終止反應(yīng)。離心上述反應(yīng)樣品，取上清在λ＝420 nm（ABTS）或λ＝525 nm處（SGZ）檢測吸光值。一個單位的酶活定義為每分鐘氧化1μmol底物所需的酶量[7]。

1.2.3 包埋法固定芽胞 芽胞的固定化方法參考已有的報道[8]進(jìn)行，并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)匦薷?。操作步驟見圖1。芽胞的添加量為0.5~10mg/mL。根據(jù)不同載體的性質(zhì)，固定方案略有調(diào)整，見表1。

圖1 包埋法固定芽胞的技術(shù)路線Fig.1 Technical route of immobilized spores by embeddingmethod

1.2.4 吸附法固定芽胞 稱取1 g載體，根據(jù)需要進(jìn)行預(yù)處理，DEAE-纖維素的預(yù)處理方式詳見表中列出的參考文獻(xiàn)。將處理好的載體投入20mL緩沖液中，添加適量芽胞，在37℃，200 r/min及一定pH條件下，吸附12 h，抽濾，收集濾出液（上清液）用于檢測固定化率。用檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀3次，自然干燥備用。

表1 包埋法所用載體及處理條件Table 1 Embedding carriers and treatment conditions

表2 吸附法所用載體及處理條件Table 2 Adsorption carriers and treatment conditions

1.2.5 結(jié)合法固定芽胞 載體合成及表面修飾：殼聚糖微球按王穎等[17]報道的方法進(jìn)行。氨基功能化二氧化硅粒子（APS）按Ruan等[18]報道的方法進(jìn)行合成。PEI涂敷的PVA海綿的制備：將成塊的PVA海綿切成2 mm×2 mm×2 mm小塊，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡過夜，以除去表面可能殘留的甲醛。將經(jīng)乙醇處理后的PVA海綿水洗，自然條件下干燥至恒重。將處理好的海綿按1 g∶20mL浸入水中，添加PEI到終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，在37℃、200 r/ min條件下振蕩6 h。用緩沖液洗滌3次，過濾即得PEI涂敷的PVA海綿。硅藻土的表面氨基化采用常用的APTES偶聯(lián)劑來進(jìn)行[16]。

GA交聯(lián)：將1 g制備所得的殼聚糖小球放入到含芽胞100 mg的20 mL檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，加入0.4~4%的GA交聯(lián)8 h，抽濾上述混合物，收集上清液用于檢測固定化率，濾出的固定化芽胞小球用檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌3次，保存?zhèn)溆谩?/p>

EDC交聯(lián)：稱取1 g載體置于檸檬酸磷酸鹽緩沖液中，混合均勻后加入2 mL EDC（4 mg/mL），超聲處理10 min，接著加入1 mL芽胞懸液（100 mg/ mL）使最終混合液的體積為20 mL，同樣條件下超聲處理30 min，以使其充分分散結(jié)合。將上述超聲處理的樣品置于搖床，在37℃，200 r/min條件下繼續(xù)固定12 h。固定完成后，用檸檬酸磷酸鹽緩沖液洗滌固定化產(chǎn)物3次，分別收集上清和固定化產(chǎn)物，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 共價結(jié)合法所用載體及處理條件Table 3 Carriers for covalent bonding and treatment conditions

1.2.6 不同固定化方法和載體的性能檢測與評價

式中，A1為初始酶活；A2為上清酶活；A3為固定化酶酶活。

粒徑：粒徑大于1 mm用直尺測量，小于1 mm并大于0.2mm用游標(biāo)卡尺測量，小于0.2 mm用顯微鏡測量。

5次循環(huán)檢測剩余酶活：取相同芽胞量的固定化芽胞，以SGZ來檢測固定化芽胞漆酶的重復(fù)使用能力，每次測完酶活后，傾去反應(yīng)液，用檸檬酸磷酸鹽緩沖液振蕩洗滌固定化芽胞，傾去洗滌液，然后加入反應(yīng)體系再次測酶活，如此往復(fù)，檢測5次循環(huán)反應(yīng)后剩余酶活。

數(shù)據(jù)分析方法參考王政改等[21]的報道，所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8、SPSS 19以及Excel 2003軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 芽胞漆酶固定化綜合性能

2.1.1 包埋法固定芽胞漆酶的綜合性能 表4為多種包埋方案固定化芽孢漆酶的綜合性能。在這些方案中，所有微囊化獲得的微球都具有極高的初始機(jī)械強(qiáng)度，不易被擠破或撕裂[22]。部分PVA微球有嚴(yán)重吸水膨脹現(xiàn)象，可能與PVA分子上未參與反應(yīng)的羥基與水分子快速結(jié)合有關(guān)。

2.1.2 吸附法固定芽胞漆酶的綜合性能 選擇一個適合吸附的固定化載體，需要考慮載體的表面積、粒徑、孔徑、孔結(jié)構(gòu)以及表面的功能基團(tuán)[23]。其中，孔徑以及孔結(jié)構(gòu)可能是最重要的固定化理化參數(shù)。如表5所示，所有通過物理吸附的固定化芽胞漆酶活力回收率都極低，甚至多種樹脂對芽胞幾乎沒有吸附能力。這可能是這些固定化材料的孔徑以及孔結(jié)構(gòu)造成的。芽胞的大小一般為1.2μm×0.8 μm，一般的樹脂孔徑要比其小得多[24-27]。

2.1.3 活性載體的制備與共價結(jié)合法固定芽胞漆酶的綜合性能 表6考察了4種不同載體及其固定化芽胞漆酶的綜合性能。

如表6所示，溶膠－凝膠法制備的帶有氨基的二氧化硅粒子、PEI涂敷的PVA海綿以及氨基化的硅藻土都有較高的相對酶活，而殼聚糖不論以EDC還是GA為交聯(lián)劑幾乎都沒有漆酶活性。

表4 包埋法固定芽胞漆酶的綜合性能Table 4 Comprehensive performance of immobilized spore laccase by embeddingmethod

表5 吸附法固定芽胞漆酶的綜合性能Table 5 Com prehensive performance of immobilized spore laccase by adsorption method

注：在平均直徑檢測與初始機(jī)械強(qiáng)度描述中，“－”代表未檢測或未描述；在活力回收檢測中，以本研究中DEAE-纖維素吸附芽胞的酶活回收率為“+++++”，無酶活為“－”。

表6 共價結(jié)合法固定芽胞漆酶的綜合性能Table 6 Com prehensive performance of immobilized spore laccase by covalent bonding

2.2 包埋劑、pH和交聯(lián)劑對芽胞漆酶固定化效率的影響

2.2.1 包埋劑添加量對包埋法固定化芽胞漆酶效率的影響 包埋劑添加量、交聯(lián)劑添加量、芽胞量、添加劑添加量以及交聯(lián)固定時間都會影響芽胞漆酶的活力回收和穩(wěn)定性。其中，包埋劑的選擇和添加量對此二者的影響作用尤為明顯。當(dāng)包埋劑含量較低時，固定化芽胞微球硬度較低，易被溶解。隨著包埋劑含量的增加，固定化芽胞微球的硬度逐漸增加，利用注射器滴加的難度越大，也越容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。在本研究中，SA、PVA-瓊脂和瓊脂3種包埋方案其最適的包埋劑添加量分別為 2%、9%（PVA）和2%（數(shù)據(jù)未顯示）。過低和過高濃度的包埋劑都不利于保留較高的酶活。包埋劑添加量的確定是包埋法固定化研究的基礎(chǔ)，要在活力回收和穩(wěn)定性中保持平衡，還需要進(jìn)一步優(yōu)化包埋劑添加量、芽胞量、添加劑添加量和交聯(lián)固定時間。

2.2.2 pH對離子結(jié)合法固定化芽胞漆酶效率的影響DEAE-纖維素是一種弱堿性陰離子交換劑，其表面的二乙氨基乙基帶正電，可以吸附帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從而達(dá)到分離的目的。pH和離子強(qiáng)度是控制蛋白質(zhì)離子交換行為、分辯率和回收率的重要參數(shù)，其中，pH決定了目標(biāo)分子及離子交換劑帶電荷的情況，因而是決定目的物是否發(fā)生吸附的最重要的參數(shù)。圖2為DEAE-纖維素在不同pH條件下吸附芽胞對固定化效率的影響。芽胞漆酶在堿性條件下具有更高的相對酶活，在pH 10的條件下達(dá)到最大值，而在pH 5的條件下，芽胞漆酶的相對酶活不到pH 10的條件下酶活的40%。

標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（p＜0．05），標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著（p＜0．01）圖2 pH對離子結(jié)合法固定化芽胞漆酶效率的影響Fig.2 Effect of pH on immobilization efficiency of spore laccase via ionic bonding

2.2.3 EDC與GA對共價結(jié)合法固定化芽胞漆酶效率的影響 EDC和GA都是常用的雙功能交聯(lián)劑，然而在添加相同芽胞量的情況下，通過不同的交聯(lián)劑以及同種交聯(lián)劑不同添加量處理得到的固定化酶活力回收差異較大。如圖3所示，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的GA用作交聯(lián)劑是合適的，過低濃度的GA不能提供足量的反應(yīng)基團(tuán)，而過高濃度的GA會破壞酶的活性中心。以殼聚糖為載體進(jìn)行芽胞固定，幾乎沒有酶活回收。這可能是因?yàn)闅ぞ厶欠肿又泻胸S富的羥基和氨基，GA在殼聚糖與芽胞同時存在的情況下，會優(yōu)先使殼聚糖表面的氨基之間產(chǎn)生交聯(lián)；而以EDC為交聯(lián)劑時，EDC可能與殘余的羧基發(fā)生反應(yīng)，最終無法固定芽胞。EDC是一種異雙功能交聯(lián)劑，在交聯(lián)過程中能夠活化羧基和氨基，使之結(jié)合生成酰胺，其自身不參與連接臂的組成，對酶活的影響較小。在所有測試組中，以GA為交聯(lián)劑的固定化芽胞的相對酶活回收率都要低于以0．4 mg/mL EDC為交聯(lián)劑的固定化芽胞漆酶，這說明EDC比GA更適合用于芽胞的共價固定。此外，溶液的pH和離子強(qiáng)度都可能影響EDC的偶聯(lián)效率，在含N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的情況下，EDC的偶聯(lián)效率一般會更高。

2.3 載體與固定化方案的選擇

標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著（p＜0．05），標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著（p＜0．01）圖3 EDC與GA對共價結(jié)合法固定化芽胞漆酶效率的影響Fig.3 Effects of EDC and GA on immobilization efficiency of spore laccase via covalent bonding

選擇合適的固定化載體需要考慮到成本、酶活力回收、可重復(fù)利用率、適用的反應(yīng)器以及固定化酶在特殊條件下的穩(wěn)定性等多個方面。綜合多種參考因素作者對最終選出的5種可供進(jìn)一步研究的載體及固定化方案進(jìn)行了對比分析。以PVA-瓊脂為載體固定化芽胞漆酶的酶活力回收高、重復(fù)利用率好，但由于其在磷酸鹽緩沖液中粘連成膠狀物質(zhì)，故可能只適用于具特殊要求的固定化應(yīng)用。氨基化二氧化硅粒子作為載體，擁有較高的酶活力回收率，但制備過程略為繁瑣，成本較高。氨基化的硅藻土成本一般，但粒徑極小，且常沉降在反應(yīng)池底部，對反應(yīng)器有較高的要求。PVA海綿是一種新型的固定化材料，在分散性、分離容易度以及成本方面都有優(yōu)勢，但所得固定化酶的活力回收率是五種方案中最低的。相對而言，DEAE-纖維素通過離子鍵與芽胞結(jié)合，各方面都有良好的性能，是所有實(shí)驗(yàn)對象中最合適的載體。

3 結(jié)語

通過大量的對比研究，縮小了芽胞固定化載體的選擇范圍，比較全面地獲得了芽胞固定化的經(jīng)驗(yàn)，得到了一種適合固定化芽胞的材料——DEAE-纖維素。芽胞以EDC為交聯(lián)劑，與氨基化的載體進(jìn)行共價結(jié)合，具有良好的固定化性能，可作為芽胞固定化的備選方案。

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Immobilization of Spore Laccase:Com parative Studies and Carriers Selection

ZHOUWen1，2， GUAN Zhengbing1，2， CAIYujie1，2， ZHAO Hong1，2， LIAO Xiangru*1，2
（1.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，M inistry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The comparative studies for immobilization of spore laccasewere carried outusing 19 differentmethodsand 12 carriers.Theoptimalcarrierandmethodwere determ ined by theactivity yield，reusability，and costof the immobilized spore laccase.The ionic bondingmethod using DEAE-celluloseas the carrierwasselected as the bestmethod.The strong diffusion lim itationswere observed when the spore laccasewas immobilized by embeddingmethod.Them icrospheresm ight dissolve and swell if sem i-embeddingmethod wasused.The smallpore sizemade itdifficult for porousmaterials to immobilized spore laccase.Theexcellent immobilization propertieswere achieved when the sporeswere covalently bound to the carriersusing carbodiim ideas the crosslinker.Itwas thus recommended asan alternativemethod.

spore laccase，embedding，adsorption，ionic bonding，covalentbonding

Q 814.2

A

1673—1689（2017）04—0363—07

2015-06-05

國家自然科學(xué)基金項目（31101331）；江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（KF201304）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目；111引智計劃（111-2-06）；江蘇省現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心項目。

*通信作者：廖祥儒（1964—），男，江西贛州人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物生物化學(xué)研究。

E-mail：liaoxiangru@163.com

周穩(wěn)，管政兵，蔡宇杰，等.芽胞漆酶的固定化方法對比研究與載體選擇[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（04）：364-370.