周 翠

（東阿縣林業(yè)局，山東 東阿 252200）

粘帚霉（Gliocladiumsp.），屬半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，是一種分布廣泛的土壤習居菌和重寄生菌，具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、寄主范圍廣、寄生能力強、拮抗機制多樣等優(yōu)點，被認為是目前已發(fā)現(xiàn)的拮抗微生物中極具潛力的生防因子之一[1-2］。粉紅粘帚霉（G.roseum，無性階段拉丁文名稱為Clonostachys rosea）是得到廣泛的研究和應用的粘帚霉之一，絲狀真菌，在生長周期內可以產(chǎn)生3種繁殖體，包括菌絲體、分生孢子和厚垣孢子[3-5］。粉紅粘帚霉的生存環(huán)境十分廣泛，熱帶雨林，溫帶，靠近北極地區(qū)以及世界上的沙漠地帶均有粉紅粘帚霉分布。據(jù)報道，耕地、草地、荒野、淡水、海灘以及鹽堿地都可能分離到粉紅粘帚酶[6］。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：粉紅粘帚霉分離自于山東省濰坊市臨朐縣蘋果枝干部輪紋病病斑，分離純化后保存。

1.2 方法

1.2.1 粉紅粘帚霉的菌落特征

在活化培養(yǎng)3～5d的粉紅粘帚霉菌落邊緣用5mm的無菌打孔器打取菌餅，轉接到已制備好的9cm直徑的PDA平板中央，重復3組實驗，將接種好的PDA平板放置在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察和記錄粉紅粘帚霉菌落顏色、邊緣整齊程度、質地、氣生菌絲梳密和發(fā)達程度、菌株產(chǎn)生色素的情況等變化。

1.2.2 粉紅粘帚霉的形態(tài)特征

當純化培養(yǎng)的粉紅粘帚霉菌落顏色開始變?yōu)榉奂t色時，用無菌解剖針挑取菌落邊緣菌絲置于載玻片上制成臨時裝片，在顯微鏡下觀察粉紅粘帚霉產(chǎn)孢結構，菌絲形態(tài)以及孢子形態(tài)特征。

1.2.3 粉紅粘帚霉分子生物學鑒定

1.2.3 .1 液體培養(yǎng)與菌絲的獲得

搖菌：在經(jīng)過純化的粉紅粘帚霉菌落邊緣用打孔器打取五個菌餅，將菌餅接種到PD（液體馬鈴薯）培養(yǎng)基中，28℃，200rpm恒溫搖床上培養(yǎng)2d。

菌絲抽提：將培養(yǎng)好的菌絲用真空泵及布式漏斗抽提，除去培養(yǎng)液，獲得干燥的粉紅粘帚霉菌絲，然后用烘箱65℃烘干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 .2 DNA的提取

采用CTAB法提取粉紅粘帚霉DNA。

1.2.3 .3 PCR擴增

設置 25 μL 反應體系為 10×PCR buffer2.5μL，dNTP 1μL，ITS1 引 物 2μL，ITS4 引物 2μL，Taq 酶0.5 μL，Mg2+1μL，DNA 模板 2μL，ddH2O 14μL；其PCR擴增條件：94℃預變性 3min，94℃變性 1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 2min，重復步驟上述 30次，72℃延伸10 min。將獲得PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中取5 μL電泳，觀察目標片段的大小。

1.2.3 .4 CR產(chǎn)物的純化回收和測序

擴增后的目標片段按試劑盒說明進行純化回收，將回收的PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.2.3 .5 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將測定的菌株ITS序列提交到NCBI上，并用BLAST進行同源性序列比對，確定菌株的分類地位。在所測定的相關基因序列的基礎上，再從Gen-Bank上搜集與測序菌株相關的序列，并首先對測定序列用Clustalx1.83進行序列對齊，刪除缺失位點、殘缺位點、非編碼序列位點，然后利用MEGA 5.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，以自展法（bootstrap）進行檢測，共循環(huán)1,000次，用鄰接法構建菌株序列的鄰接樹。

2 結果與分析

2.1 粉紅粘帚霉的菌落特征觀察

在PDA培養(yǎng)基上，菌絲初為白色，邊緣整齊，菌絲匍匐，較疏松，氣生菌絲不發(fā)達，后菌絲變?yōu)榉奂t色，菌落表面有少許水溢出，菌落底有橙紅色色素產(chǎn)生（見圖 1）。

圖1 粉紅粘帚霉菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of Clonostachys

2.2 粉紅粘帚霉的顯微形態(tài)特征觀察

分生孢子梗掃帚狀分枝。分生孢子橢圓形，粘連在一起聚集成團狀，菌絲無色，有隔膜，并且具有與其功能相適應的菌環(huán)（見圖2）。

圖2 粉紅粘帚霉的形態(tài)特征Fig.2 Structure characterastics of Clonostachys rosea A粉紅粘帚霉的產(chǎn)孢結構B分生孢子C菌絲D菌環(huán)結構

2.3 粉紅粘帚霉菌株ITS序列測定

通過對菌株的rDNA ITS進行PCR擴增，其電泳結果見圖3。對PCR擴增后的基因序列進行凝膠電泳，用2Kb Maker進行對照，我們發(fā)現(xiàn)所得序列大小約為600bp。

圖3 部分菌株ITS序列電泳圖Fig.3 The electrophorogram of ITS

2.4 粉紅粘帚霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

通過構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析樹我們可以發(fā)現(xiàn)，本次試驗所用的菌株編號為JF817331.1，它的分類地位為半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，粉紅粘帚霉。與已知編號為KP670432.1的粉紅粘帚霉菌株具有最近的親緣關系。在一定程度上我們可以通過系統(tǒng)發(fā)育分析樹得 到供試菌株的分類地位并參照親緣關系較近的已知菌株的特性推測供試菌株的形態(tài)特征等生物學特性。

圖4 粉紅粘帚霉菌株分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析樹Fig.4Phylogenetic tree of Clonostachys rosea strain

3 結論與討論

菌落形態(tài)顯示，粉紅粘帚霉菌絲初為白色，邊緣整齊，菌絲匍匐，較疏松，氣生菌絲不發(fā)達，后變?yōu)榉奂t色，菌落表面有少許水溢出，菌落底部有橙紅色色素產(chǎn)生，通過對粉紅粘帚霉的培養(yǎng)觀察可以看到粉紅粘帚霉可以產(chǎn)生大量分生孢子。ITS序列測定表明，該菌株與genbank中提交的粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）菌株同源性達到100%，上述研究明確了該菌株為半知菌門，絲孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，粘帚霉屬，粉紅粘帚霉。

[1］Domsch,K.H.Compendium of Soil Fungi[M］.London,Academic Press,1980.

[2］趙士振，粉紅粘帚霉防治果蔬灰霉病的研究[D］.華中農(nóng)業(yè)大學，2015.

[3］董佩佩，等.粉紅粘帚霉67-1厚垣孢子形成與貯存研究.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2013，（10）：48-50.

[4］楊榮華.粘帚霉GR菌株高產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶誘變、酶分離與性質研究及菌株鑒定[D］.揚州，揚州大學：2010，26.

[5］王春蘭，郭順星，等.粉紅粘帚霉化學成分的研究[J］.微生物學通報,2001，28（4）：24-26.

[6］馬桂珍，王淑芳，等.土壤因子對生防真菌粉紅粘帚霉67-1消長動態(tài)的影響 [J］.中國生物防治學報，2013，29（1）：97-103.