吳自祥，萬學瑞,馬亞茹，王 艷，吳 潤，王 川，魏 姣，劉 磊，張小麗，張?zhí)炝?，楊潤霞，賈曉蕊

(甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，甘肅 蘭州 730070)

產纖維素酶細菌的分離篩選與鑒定

吳自祥，萬學瑞,馬亞茹，王 艷，吳 潤，王 川，魏 姣，劉 磊，張小麗，張?zhí)炝?，楊潤霞，賈曉蕊

(甘肅農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，甘肅 蘭州 730070)

通過篩選獲得高產纖維素酶細菌菌株，為纖維素酶制劑研制及纖維素酶工程菌構建提供試驗材料。采用剛果紅平板從牛羊糞便及腐敗的玉米秸稈和木屑中分離產纖維素酶菌株，以DNS法測定酶活，根據酶活復篩產纖維素酶分離菌株；觀察分離菌株的形態(tài)、染色與培養(yǎng)特性；應用16S rDNA通用引物擴增菌株基因組DNA，測序結果提交GenBank數(shù)據庫進行Blast比對分析和相似性搜索，作出復篩菌株種的鑒定。結果表明：分離獲得16株纖維素酶產量較高的細菌菌株，均為革蘭氏陽性菌，菌體呈短桿狀、具中央芽孢，經16S rDNA序列比對分析和相似性搜索，鑒定為10株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、6株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

纖維素酶；16S rDNA；分離；鑒定；枯草芽孢桿菌；解淀粉芽孢桿菌

隨著世界經濟的快速發(fā)展，能源需求量急劇上升，為了實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，世界各國均在尋求新的替代能源，如風能、核能、太陽能、生物質能等等。在各種新型的替代能源中，纖維素燃料乙醇是公認的最具有發(fā)展前景的能源。地球上每年光合作用可產生大于50億t以上的纖維素和半纖維素[1]，纖維素物質是地球上分布最為廣泛、含量最為豐富的碳水化合物[2]。利用現(xiàn)代生物技術將纖維素轉化為乙醇等液體燃料，有希望解決能源危機、環(huán)境污染和糧食危機等問題[3]，此外還可以實現(xiàn)對農業(yè)產品剩余價值的高效利用。以纖維素作為原料生產乙醇，產量穩(wěn)定、可再生和無污染，但目前利用纖維素物質生產乙醇的成本很高，缺少具有商業(yè)應用價值的高效酶制劑。因此，開發(fā)新的高活性纖維素酶酶制劑成為人們關注的熱點，選育纖維素酶高產菌株尤為重要。目前對纖維素酶產生菌的研究多集中在真菌，以木霉屬、青霉屬和曲霉屬更為常見，而對細菌的報道較少。近20年來，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉紡織品的水洗工藝和洗滌劑中的成功應用，細菌纖維素酶酶制劑也顯示出良好的應用前景[4]。從蘭州市周邊村莊植物秸稈、牛羊糞便、枯枝敗葉中篩選高產纖維素酶細菌菌株，進行分離菌株表型特性和16S rDNA序列鑒定及其酶學研究，以期獲得纖維素酶高產菌株，為纖維素酶制劑研制及纖維素酶工程菌株構建提供試驗材料基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 用無菌法從蘭州市安寧區(qū)黃家灘附近采集腐敗植物秸稈、碎木屑、牛羊糞便及枯枝落葉及土壤等10份樣品，供纖維素酶產生細菌菌株分離。

1.1.2 試劑 葡萄糖、剛果紅、3,5-二硝基水楊酸等常規(guī)試劑均為國產分析純；溶菌酶、細菌基因組總DNA提取試劑盒購于BioTeke公司；Taq酶購于康潤生物科技公司；PCR產物回收試劑盒購于OMEGA公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 初篩和復篩培養(yǎng)基按文獻[5]配方和方法進行配制。

初篩培養(yǎng)基 CMC-Na 10 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨1 g，酵母膏0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH。

產酶培養(yǎng)基 CMC-Na 10 g，蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，NaCl 1 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH。

馬鈴薯培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，1 000 mL蒸餾水。馬鈴薯切片，加水煮沸30 min，紗布過濾，加葡萄糖、瓊脂，濾液補足1 000 mL，121℃滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 稱取樣品25 g，加入到盛有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，將樣品充分打散混勻，置于37℃恒溫搖床搖動2 d備用。

立體倉庫巷道兩側為一組貨架，貨架位置固定、大小一致，每個貨位最多存放一件貨物。巷道兩端各有一個出/入庫臺，同一巷道上設置兩臺堆垛機同時進行揀選作業(yè)，各自從其對應的出/入庫臺執(zhí)行存/取任務。兩臺堆垛機性能一致，最多承載一個貨物。立體倉庫實例仿真基本參數(shù)如表1所示。

1.2.2 初篩 用無菌生理鹽水稀釋樣品溶液，取10-1～10-33個稀釋度各0.1 mL樣液分別涂布于初篩培養(yǎng)基平板，每個稀釋度涂3個平板，28℃培養(yǎng)2 d。選擇長勢良好的單菌落點種于初篩培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)2 d，用1 mg/mL的剛果紅染色液染色30 min，再用1 mmol/L NaCl溶液脫色2遍。若菌株產生纖維素酶，在菌落周圍會出現(xiàn)清晰的透明水解圈，挑選菌落周圍有明顯透明圈的菌株繼續(xù)進行純化與復篩。

1.2.3 純化與復篩 將初篩選出的菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上進行劃線，再挑取單菌落點種于初篩培養(yǎng)基，經剛果紅染色仍能產生水解圈者，進行革蘭氏染色與鏡檢，觀察其染色特性和形態(tài)特征均一性。重復上述試驗，確保獲得分離菌株的純培養(yǎng)物。根據水解圈直徑/菌落直徑的比值大小，選出纖維素酶酶活相對較高的菌株，移置培養(yǎng)基斜面于28℃培養(yǎng)1～2 d，置普通冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 分離菌株形態(tài)與染色及菌落形態(tài)觀察 將復篩出的分離菌株劃線接種于馬鈴薯培養(yǎng)基平板，置28℃培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落形態(tài)。挑取菌落抹片、革蘭氏染色與鏡檢，觀察分離菌株菌體形態(tài)與染色特性。

1.2.5 分離菌株的16S rDNA序列分析與鑒定 參照文獻[6]方法進行，進行各復篩菌株16S rDNA的擴增、測序及序列比對分析，作分離菌株種的鑒定。

(1)菌株基因組總DNA提取 將待鑒定菌株分別接種馬鈴薯液體培養(yǎng)基，置28℃轉速200 r/min搖床培養(yǎng)72～96 h，用細菌基因組總DNA提取試劑盒按其操作說明分別提取各菌株基因組總DNA，置-20℃保存?zhèn)溆茫?2)菌株16S rDNA序列擴增與測序 設計并合成16S rDNA擴增通用引物。上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物 5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海生工公司合成。

以提取的菌株基因組總DNA為模板，分別進行各菌株的16S rDNA序列擴增。PCR擴增體系(50 μL)：模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，Taq預混酶(TaKaRa)25 μL，水19 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止反應。取PCR擴增產物4 μL作1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若擴增產物大小與預期結果相符，將擴增產物純化后送上海生工公司測序；(3)菌株16S rDNA序列分析與菌株鑒定 提交各菌株16S rDNA序列于GenBank數(shù)據庫，經Blast相似性搜索，獲取相近典型菌株的基因序列，作出各分離菌株種的鑒定。

1.2.6 分離菌株產纖維素酶性質鑒定 將鑒定出的菌株接種于裝有50 mL產酶培養(yǎng)基容量為250 mL的錐形瓶中，28℃轉速200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，然后4 000 r/min離心10 min收集上清液，得粗酶液。取0.5 mL粗酶液，分別以濾紙、CMC-Na[7]，Avicel[8]和水楊苷[9]作為底物，用DNS方法[10]確定各菌株產酶性質并測定內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶酶活，通過Spss軟件處理酶活數(shù)據。

2 結果與分析

10份樣品處理液涂布于初篩培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，選擇單菌落點種初篩培養(yǎng)基平板再培養(yǎng)后，用剛果紅染色觀察。有86個菌落周圍有明顯水解圈，均為細菌菌落，且菌落較大，直徑在10～20 mm。

2.2 菌株復篩

進行劃線純化培養(yǎng)，共獲得86株產纖維素酶細菌菌株。再進行各菌株的產酶復篩試驗，根據水解圈直徑/菌落直徑之比，篩選出16株相對酶活較高的菌株(表1)。

2.3 菌落形態(tài)及個體形態(tài)

復篩分離株菌落呈乳白色或肉粉色，直徑10～20 mm，大小不等，形狀不一，多數(shù)扁平，邊緣有的整齊、有的呈放射狀或裂葉狀，表面有的濕潤且粘稠、有的表面干燥且有皺褶。革蘭氏染色均為陽性，多數(shù)菌株菌體呈短桿狀，中間有芽孢生成，芽孢不大于菌體橫徑。

表1 16株產纖維素酶細菌水解圈與 菌落直徑比較Table 1 Hydrolysis circle and colony diameter of 16 cellulase producing strains

2.4 菌株16S rDNA鑒定結果

試驗以總DNA為模板，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增其16SrDNA片段，得到大小1 500 bp

的DNA片段(圖1)。經各菌株16S rDNA序列在GenBank中作同源性檢索分析，16株分離菌16S rDNA序列與GenBank中已注冊參考菌株的16S rDNA序列同源性均高于99%，可鑒定為10株枯草芽孢桿菌、6株解淀粉芽孢桿菌(表2)。用DNA Star生成系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖2)。

圖1 部分菌株16S rDNA PCR擴增Fig.1 The results of 16S rDNA PCR amplification of some strains注：1～4.16S rDNA的PCR擴增產物；M.2 000 bp DNA 分子質量標準

順序菌株編號參考菌株16SrDNA序列號同源性/%鑒定結果AC-3HQ143563.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BB-3KM226924.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)CG-2JX316756.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)DB-1KF496886.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ED-2KM488323.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)FH-3KF954553.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)GH-1GQ853414.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)HA-1GQ861468.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)IB-5KF001839.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JH-2KJ149810.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB-7JQ695930.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)LC-2HM055602.199枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)MJ-1JQ346075.1100枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NL-3GU323369.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)OK-2KM365462.1100枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)PM-1HM055603.199解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)

2.5 菌株產纖維素酶性質的鑒定

用DNS方法測定16株分離菌的3種纖維素酶酶活，并通過SPSS軟件處理酶活數(shù)據，1株細菌具有內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶3種纖維素酶活性，5株細菌具有內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶兩種酶活性，2株菌具有內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶兩種酶活性，8株細菌僅具有內切葡聚糖酶活性(表3)。

表3 產纖維素酶菌株酶活Table 3 The activity of cellulase producing strains U/mL-1

注：“-”表示無酶活

圖2 16株菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenctic tree of 16S rDNA of 16 strans

3 討論

地球上可以分解纖維素的微生物種類繁多，有真菌、細菌、放線菌等[11]。細菌所產生的纖維素酶最適pH為中性至偏堿性，因其水解纖維素作用較弱，長期以來沒有得到足夠的重視。但是，從環(huán)境保護和動物營養(yǎng)等方面來看，對厭氧菌或兼性厭氧菌的研究尤為重要，因為污物纖維素類的分解及飼料發(fā)酵加工等大都在缺氧環(huán)境下進行，真菌則處于弱勢地位。并且，細菌纖維素酶對酸堿耐受性強，最適反應溫度范圍廣，耐高溫，更有利于工業(yè)生產。

試驗用剛果紅染色法篩選產纖維素酶的菌，方法簡單快速，通過水解圈直徑與菌落直徑之比能直接反應該菌產纖維素的能力，其原理是剛果紅能與大分子多糖結合[12]。應用16S rDNA序列分析的分子生物學技術并結合形態(tài)學觀察，能夠快速準確地對菌株種屬進行鑒定。采用DNS方法測定菌株酶活，此方法操作簡便，但其存在一定誤差，可以對菌株之間的酶活相對高低進行比較，為篩選高酶活菌株提供理論依據。

研究所篩選出的16株菌均產芽孢，屬于芽孢桿菌屬，其中，枯草芽孢桿菌是目前研究最多的產纖維素酶細菌。試驗分離出新的產纖維素酶菌株，細菌產纖維素酶的種類較少，并不是每一株細菌均能產生3種纖維素酶，這也是導致細菌纖維素酶活力較低的原因之一。分離出的解淀粉芽孢桿菌L-3，與國內報道的用相同方法篩選出的高酶活細菌菌株[13-16]相比較高，其中CMC酶活高達240.311 U/mL，且仍可進一步對其優(yōu)化和誘導，提高其纖維素酶活力，具有相當廣闊的理論價值和應用前景。

4 結論

此次研究共篩選出16株產纖維素酶的細菌，經鑒定均為芽孢桿菌屬，10株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，6株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

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Isolation screening and identification of cellulase producing bacteria

WU Zi-xiang,WAN Xue-rui，MA Ya-ru，WANG Yan，WU Run，WANG Chuan，WEI Jiao，LIU Lei，ZHANG Xiao-li，ZHANG Tian-liang,YANG Run-xia，Jia Xiao-rui

(CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering，the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains wereBacillussubtilis,6 strain wereBacillusamyloliquefaciens.

cellulase；16S rDNA；isolation；identification；Bacillussubtilis；Bacillusamyloliquefaciens

2016-09-08；

2016-11-02

甘肅省科技支撐計劃項目(1204NKCA103)；甘肅省農業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW.2012-25)；甘肅農業(yè)大學盛彤笙科技創(chuàng)新基金項目(GSAU-STS-1232)資助

吳自祥(1991-)，男，甘肅白銀人，在讀碩士研究生。 萬學瑞(1979-)，女，甘肅白銀人，副教授，博士，主要從事預防獸醫(yī)學研究工作。對全文有同等貢獻，并列第一作者。 E-mail：383921499@qq.com

Q 939.99

A

1009-5500(2017)02-0007-06

吳潤為通訊作者。