陶亞群，彭小琴，李佩，王浩然，李聰，魯紅雪，章松柏(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

吳祖建 (福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建 福州350002)

南方水稻黑條矮縮病毒P8蛋白的定位和致病性分析

陶亞群，彭小琴，李佩，王浩然，李聰，魯紅雪，章松柏
(長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

吳祖建
(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建 福州350002)

P8是南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)編碼的一種外殼蛋白，該蛋白的其他功能未知。利用馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)異源病毒載體和pEarleyGate101在本氏煙(Nicotianabenthamiana)中表達(dá)了P8，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察這些蛋白的亞細(xì)胞定位情況，分析該蛋白的表達(dá)對(duì)本氏煙的影響。 結(jié)果顯示：P8主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中形成顆粒狀聚集體；與PVX空載體侵染的本氏煙相比，P8蛋白的表達(dá)能夠促使本氏煙表現(xiàn)出一定程度的花葉和新葉皺縮癥狀，推測(cè)可能參與病毒的致病性過(guò)程。

南方水稻黑條矮縮病毒；結(jié)構(gòu)蛋白；致病性；亞細(xì)胞定位

南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)最早由周?chē)?guó)輝等在水稻上發(fā)現(xiàn)并命名的一種新的植物呼腸孤病毒[1～4,8]。該病毒主要由遷飛性害蟲(chóng)白背飛虱以持久性方式進(jìn)行傳播[5～7]，可以寄生危害水稻、玉米、高粱等多種禾本科作物及雜草[2,8,9]，因其在糧食生產(chǎn)上造成的巨大損失，引起了各國(guó)家學(xué)者的高度關(guān)注[10～13]。自病毒發(fā)現(xiàn)以來(lái)，廣東、廣西、湖南、云南、海南、湖北、安徽等地分離株的基因組相繼被測(cè)定[4,14,15]，一些病毒編碼的蛋白功能也逐漸被揭示，如Pns6為病毒的基因沉默抑制子[16]；Pns71形成管狀蛋白[17]；Pns91為基質(zhì)蛋白，與病毒的復(fù)制密切相關(guān)[18]，而且Pns51和Pns6互作在病毒基質(zhì)的形成中起重要作用[19]，Pns51、Pns6和Pns91對(duì)于病毒粒子和纖維絲狀結(jié)構(gòu)域的形成起關(guān)鍵作用[19,20]。

蛋白質(zhì)的功能與其亞細(xì)胞位置有著密切的聯(lián)系，病毒蛋白只有在細(xì)胞內(nèi)正確定位才能發(fā)揮其正常的生物學(xué)功能，在寄主植物上表現(xiàn)不同的癥狀。如RSV CP和NSvc4蛋白定位于葉綠體中[21]，RSV CP在本氏煙中引起葉片的褪綠形成花葉癥狀，在發(fā)病水稻中CP在葉綠體中的積累量與水稻葉片的褪綠成正相關(guān)，被認(rèn)為引起水稻葉片條紋癥狀[21,22]；SRBSDV Pns92分散于整個(gè)細(xì)胞，定位于細(xì)胞質(zhì)中或膜上，形成絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[23]，Pns92引起本氏煙葉片沿葉脈處形成濃綠，而SRBSDV在水稻葉片上引起濃綠癥狀，這與Pns92在本氏煙引起的沿葉脈處濃綠癥狀相一致，推測(cè)Pns92可能與病毒的致病性相關(guān)[24]等等。

P8是南方水稻黑條矮縮病毒編碼的一種外殼蛋白，而該蛋白的其他功能未知。本研究利用馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)異源病毒載體和pEarleyGate101在本氏煙中表達(dá)P8，通過(guò)熒光共聚焦顯微鏡觀察該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，分析P8的表達(dá)對(duì)本氏煙影響，為SRBSDV病毒蛋白的功能及致病性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株和載體

SRBSDV侵染的水稻材料于2009年9月采集于湖北省公安縣發(fā)病田間，本氏煙為長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室自留種保存，2種植物材料均種植于該實(shí)驗(yàn)室光照溫室中；農(nóng)桿菌EHA105為長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存菌株，大腸桿菌DH5( 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；克隆載體pMD 18-T購(gòu)自Takara公司；致病性分析使用的馬鈴薯X病毒載體由浙江大學(xué)周雪平老師課題組惠贈(zèng)，陽(yáng)性對(duì)照PVX-RSV-CP(水稻條紋病毒(Rice stripe virus)的外殼蛋白)重組載體和定位載體pEarleyGate101由福建農(nóng)林大學(xué)魏太云老師課題組惠贈(zèng)，其它相關(guān)試劑皆購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法1.2.1 PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)SRBSDV湖北分離物序列(S10-S1，登陸號(hào)為：HM585270-HM585879)，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增病毒P8基因的含酶切位點(diǎn)和重組位點(diǎn)的引物見(jiàn)表1。

表1 用于病毒基因片段擴(kuò)增的引物

1.2.2 PVX重組載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

通過(guò)RT-PCR獲得病毒相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物并回收，重組至克隆載體pMD 18-T中，測(cè)序驗(yàn)證正確后通過(guò)酶切連接構(gòu)建重組終載體PVX，標(biāo)記為PVX-P8。將重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行，最后通過(guò)菌落PCR鑒定重組農(nóng)桿菌。

1.2.3 pEarleyGate101重組載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

通過(guò)RT-PCR獲得病毒相關(guān)基因的PCR產(chǎn)物并回收，重組至克隆載體pMD 18-T中，測(cè)序驗(yàn)證正確后通過(guò)酶切連接構(gòu)建重組終載體pEarleyGate101，標(biāo)記為YFP-P8。將重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照文獻(xiàn)[25]的方法進(jìn)行，最后通過(guò)菌落PCR鑒定重組農(nóng)桿菌。

1.2.4 農(nóng)桿菌侵染本氏煙

取健康的本氏煙葉片，參照Sparkes等[26]的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染本氏煙試驗(yàn)：注射含有PVX空載體(陰性對(duì)照)、PVX-RSV-CP(陽(yáng)性對(duì)照)、PVX-P8、pEarleyGate101(空)和YFP-P8等重組農(nóng)桿菌到本氏煙葉片，然后進(jìn)行致病癥狀和蛋白亞細(xì)胞定位觀察，每個(gè)樣品處理每次注射3～5 株，試驗(yàn)重復(fù)3 次，致病性觀察于處理后第5、9、15d記錄癥狀表現(xiàn)，亞細(xì)胞定位觀察于處理后48h進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用表1中病毒基因的引物擴(kuò)增SRBSDVP8基因的全長(zhǎng)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物的大小與所測(cè)定的SRBSDV湖北分離物相應(yīng)基因序列的大小一致。克隆后，通過(guò)酶切將其連接到pEarleyGate101載體上。最后質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了病毒P8結(jié)構(gòu)蛋白的熒光定位載體，并攜帶YFP黃色熒光蛋白序列，標(biāo)記為YFP-P8。

2.2 P8在本氏煙細(xì)胞中的定位

將構(gòu)建好的P8基因重組熒光定位終載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)體系表達(dá)P8和YFP的融合蛋白，激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白黃色熒光在細(xì)胞中的分布，結(jié)果如圖1。對(duì)照YFP定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，P8主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中形成顆粒狀聚集體。

標(biāo)尺：100μm ；Chl：葉綠體圖1 P8蛋白的亞細(xì)胞定位

2.3 P8能引起花葉癥狀

借助重組農(nóng)桿菌介導(dǎo),(重組)PVX侵染本氏煙試驗(yàn)結(jié)果顯示：供試本氏煙在5d左右開(kāi)始發(fā)病，9d左右癥狀趨于穩(wěn)定(圖2，白色方框示系統(tǒng)葉癥狀表現(xiàn))，15d后絕大多數(shù)本氏煙癥狀逐漸消失；陰性對(duì)照PVX空載侵染后形成輕微的花葉，陽(yáng)性對(duì)照PVX-RSV-CP的系統(tǒng)葉表現(xiàn)出典型花葉癥狀(圖2-B)，與PVX空載體侵染的本氏煙相比，P8的表達(dá)能夠促使本氏煙表現(xiàn)出一定程度的花葉和新葉皺縮癥狀，推測(cè)可能參與病毒的致病性過(guò)程。

圖2 SRBSDV P8的致病性鑒定

3 討論

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，它由執(zhí)行不同機(jī)體功能的亞細(xì)胞組成，而亞細(xì)胞功能是由位于其中的蛋白質(zhì)執(zhí)行的，蛋白質(zhì)的正確定位關(guān)系到細(xì)胞的正常運(yùn)轉(zhuǎn)和寄主植物的正常生長(zhǎng)。病毒侵染過(guò)程中的基因組復(fù)制、蛋白表達(dá)、粒體組裝及細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)、病毒蛋白與寄主蛋白的互作等活動(dòng)都是在特定的亞細(xì)胞位點(diǎn)完成。因此，病毒致病蛋白的致病性或引起癥狀的特征往往與其亞細(xì)胞定位有一定的相關(guān)性。有些病毒的致病蛋白定位于葉綠體，如RSV NSvc4和CP、CMV的CP等[25,31]，而有些病毒的致病蛋白不需要定位于葉綠體中，它們分散于細(xì)胞中，或定位于細(xì)胞膜上，或定位于細(xì)胞核中，如TMV 6K、RSV SP、ToLCNDV NSP等蛋白[23,31～34]。P8是SRBSDV編碼的一種結(jié)構(gòu)蛋白，除此之外，該蛋白的其它功能未知。本研究對(duì)P8進(jìn)行亞細(xì)胞定位和致病性研究，結(jié)果顯示P8主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成小顆粒狀聚集體，可引起本氏煙花葉及新葉皺縮。P8蛋白的定位與RSV CP單獨(dú)表達(dá)時(shí)相似，都是在細(xì)胞質(zhì)中形成顆粒狀結(jié)構(gòu)，單獨(dú)表達(dá)時(shí)都能引起寄主花葉癥狀。但兩者參與致病性過(guò)程可能不一樣，RSV CP和NSvc4共同表達(dá)時(shí)，CP蛋白被NSvc4拉進(jìn)葉綠體而起作用。而SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白(如Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91、Pns92)和P8都是定位于細(xì)胞質(zhì)[23]，因此可能在細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行致病性作用。已報(bào)到研究結(jié)果顯示非結(jié)構(gòu)蛋白中只有Pns92能引起典型的致病癥狀(花葉)，可能Pns92在SRBSDV的致病性過(guò)程中其關(guān)鍵作用[24]。結(jié)合本研究P8的亞細(xì)胞定位和致病性分析結(jié)果，推測(cè)P8可能參與病毒的致病過(guò)程，配合Pns92等蛋白起致病作用，它們之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

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[編輯] 余文斌

2016-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301638)。

陶亞群(1991-)，女，碩士生，研究方向?yàn)榉肿又参锊《緦W(xué)。通信作者：章松柏, yangtze2008@126.com。

S432.1;Q786

A

1673-1409(2017)06-0049-05

[引著格式]陶亞群，彭小琴，李佩，等.南方水稻黑條矮縮病毒P8蛋白的定位和致病性分析[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2017，14(6)：49～53.