裘紀(jì)瑩　陳相艷　吳發(fā)萍　劉孝永　周慶新　王軍華　王未名　陳蕾蕾

摘要：研究了解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發(fā)酵產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件，以無菌發(fā)酵液對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，探討了發(fā)酵溫度、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響。通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)及Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化并確定了最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度為33.82℃，接種量為4.06%，搖床轉(zhuǎn)速為152.46 r/min，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間為6 d。在最適發(fā)酵條件下預(yù)測(cè)無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑為25.65 mm，優(yōu)化后的發(fā)酵條件大大提高了發(fā)酵液的抑菌活性。

關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌；抗菌物質(zhì)；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)面法；發(fā)酵條件優(yōu)化；抑菌活性

中圖分類號(hào)：TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002—1302（2016）01—0311—04

解淀粉芽孢桿菌是一類重要的生防菌，能夠分泌脂肽、抗菌蛋白及類細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)。目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌抗菌活性的研究比較熱門，如張寶研究了解淀粉芽孢桿菌K103所產(chǎn)脂肽的分子結(jié)構(gòu)、生化特性、抗菌機(jī)理及植物生防作用；趙東洋研究了解淀粉芽孢桿菌SWB16菌株脂肽類代謝產(chǎn)物對(duì)球孢白僵菌的拮抗作用；安俊瑩等采用響應(yīng)面法優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06產(chǎn)類細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基；陳召亮等研究了解淀粉芽孢桿菌RY3產(chǎn)抗菌粗蛋白的理化性質(zhì)及其對(duì)柑橘綠霉病菌的抑菌活性；蔡文韜等研究了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)提高辣椒采后品質(zhì)的影響。

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7是筆者所在實(shí)驗(yàn)室自行篩選的1株廣譜拮抗菌株，對(duì)包括西瓜枯萎病菌、棗炭疽病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌和輪紋病菌、梨黑斑病菌、青霉病菌等典型果蔬病原真菌以及金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌等病原細(xì)菌有很好的抑制作用。同時(shí)，有研究表明，該菌產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)對(duì)采后蘋果輪紋病具有良好的防治作用，防治效果與納他霉素相當(dāng)，對(duì)梨采后青霉病的防治也有明顯效果，因此具有比較好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，本研究采用單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)該菌產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，從而提高了發(fā)酵液的抑菌活性。

1材料與方法

1.1菌種

解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離；西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium f.sp.niveum），由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2材料與試劑

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于NCPSJ7菌株的培養(yǎng)和保存；PDA培養(yǎng)基用于病原菌的培養(yǎng)、保存和牛津杯法測(cè)定抑菌活性；發(fā)酵培養(yǎng)基用于拮抗菌胞外抗菌物質(zhì)的發(fā)酵，具體配方為葡萄糖5 g，酵母浸膏7.5 g，蛋白胨7.5 g，（NH₄）₂SO₄ 5 g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH值7.0。其他試劑均為分析純。

1.3儀器與設(shè)備

CR22Gm高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；霉菌培養(yǎng)箱LRH-150-MS（廣東省韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；生化培養(yǎng)箱SHP-150（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ZWY-2102恒溫?fù)u床（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1無菌發(fā)酵液的制備 菌種活化及種子液的制備：將解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7接種于牛肉膏蛋白胨平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，得種子液。發(fā)酵：將種子液按一定比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在一定的裝液量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)一定時(shí)間，既得NCPSJ7發(fā)酵液。無菌發(fā)酵液的制備：將發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min離心20 min，棄菌體保留上清液，用0.45μm濾膜過濾，即得無菌發(fā)酵液。

1.4.2抑菌活性檢測(cè) 按文獻(xiàn)報(bào)道的方法，略有改動(dòng)。病原指示菌菌懸液制備：將西瓜枯萎病菌活化后接種于PDA平板，按文獻(xiàn)報(bào)道的方法制成孢子菌懸液，4℃保存，備用。抑菌活性的檢測(cè)：取50μL的病原指示菌菌懸液均勻涂布于PDA平板培養(yǎng)基上，待干后在平板中央放置1個(gè)無菌牛津杯，向杯中加入200μL無菌發(fā)酵液，于28℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.4.3單因素試驗(yàn) 以無菌發(fā)酵液對(duì)西瓜枯萎病菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，分別考察培養(yǎng)溫度、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌活性的影響，每組3個(gè)平行。

1.4.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用minitab軟件創(chuàng)建一個(gè)Factors=5、Runs=12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)表，每個(gè)因素選取2個(gè)水平，低水平為單因素最佳培養(yǎng)條件，高水平為低水平的1.09～1.25倍，然后按設(shè)計(jì)開展試驗(yàn)，考察各試驗(yàn)因素的重要性。

1.4.5響應(yīng)面法優(yōu)化 采用Box-Behnken法，對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的較顯著因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面及方差分析，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到多元回歸方程，在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1發(fā)酵溫度對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌效果的影響 在31～43℃之間選取5個(gè)不同水平的發(fā)酵溫度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵溫度34℃時(shí)，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強(qiáng)。

2.1.2裝液量對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌效果的影響 5個(gè)水平裝液量對(duì)抑菌效果的影響結(jié)果如圖2所示。發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為100 mL/250 mL三角瓶時(shí)，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強(qiáng)。

2.1.3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌效果的影響 5個(gè)不同水平的搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌效果的影響如圖3所示。搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強(qiáng)。

2.1.4接種量對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌效果的影響 不同的接種量對(duì)抑菌效果的影響結(jié)果如圖4所示。接種量為3.0%時(shí)，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑最大，即抑菌活性最強(qiáng)。

2.1.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌效果的影響 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響結(jié)果如圖5所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，無菌發(fā)酵液的抑菌效果也隨之增強(qiáng)，當(dāng)發(fā)酵6 d時(shí)，無菌發(fā)酵液的抑菌效果最好，之后抑菌效果呈下降趨勢(shì)。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)篩選顯著因素

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)顯著因素篩選方案，對(duì)5個(gè)因素進(jìn)行考察。各因素的參數(shù)、水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與測(cè)定結(jié)果見表2。

對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果（表3）表明，置信度大于95%的因素被認(rèn)為是顯著因素。可見，5種因素影響的顯著性順序?yàn)榘l(fā)酵溫度>接種量>搖床轉(zhuǎn)速>發(fā)酵時(shí)間>裝液量。發(fā)酵溫度和接種量對(duì)無菌發(fā)酵液的抑菌活性具有顯著影響，搖床轉(zhuǎn)速的影響雖不顯著，但影響也較大，作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。裝液量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響較小，選取單因素試驗(yàn)中的最適值：裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間6 d。

2.3響應(yīng)面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件

選取對(duì)無菌發(fā)酵液抑菌活性影響較大的3個(gè)因素（發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速）進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化，其編碼水平見表4，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與測(cè)定結(jié)果見表5。

通過上述多元回歸方程作3組響應(yīng)面和等高線圖，結(jié)果見圖6。由圖6-a可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度由低到高逐漸變化，接種量也由低到高逐漸變化時(shí)，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；由圖中等高線形狀接近圓形可知，發(fā)酵溫度和接種量對(duì)抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。由圖6-b可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度由低到高逐漸變化，搖床轉(zhuǎn)速也由低到高逐漸變化時(shí)，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；由圖中等高線形狀接近圓形可知，發(fā)酵溫度和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。由圖6-c可以看出，當(dāng)接種量由低到高逐漸變化，搖床轉(zhuǎn)速也由低到高逐漸變化時(shí)，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；由圖中等高線形狀接近圓形可知，接種量和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌圈直徑影響的交互作用不顯著。

2.4模型驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化回歸方程求得解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7發(fā)酵產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)的最適發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度33.82℃，接種量4.06%，搖床轉(zhuǎn)速152.46 r/min，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間6 d，預(yù)測(cè)的最大抑菌圈直徑為25.65 mm。

為了方便試驗(yàn)，選取發(fā)酵溫度34℃、接種量4.06%、轉(zhuǎn)速155 r/min、裝液量100 mL/250 mL三角瓶、發(fā)酵時(shí)間6 d，作3組平行，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果抑菌圈直徑的平均值為25.30 mm，接近預(yù)測(cè)值，說明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)發(fā)酵液抑菌活性情況。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7產(chǎn)胞外抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵溫度、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時(shí)間這5個(gè)因素，在此基礎(chǔ)上采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速這3個(gè)較顯著因素，然后通過響應(yīng)面法研究了各顯著因素及其交互作用對(duì)發(fā)酵產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響。通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立了解淀粉芽孢桿菌NCPSJ7無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑與發(fā)酵溫度、接種量和搖床轉(zhuǎn)速這3個(gè)較顯著因素的多項(xiàng)式模型，并確定了最適發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度33.82℃，接種量4.06%，搖床轉(zhuǎn)速152.46 r/min，裝液量100 mL/250 mL三角瓶，發(fā)酵時(shí)間6 d，預(yù)測(cè)的最大抑菌圈直徑為25.65 mm。同時(shí)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值接近，說明該模型能夠較好地反映實(shí)際發(fā)酵情況，可用于預(yù)測(cè)發(fā)酵液抑菌圈直徑與發(fā)酵條件的關(guān)系。

對(duì)于拮抗菌NCPSJ7，本試驗(yàn)只是從發(fā)酵條件方面進(jìn)行了優(yōu)化，培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵液中主要抗菌物質(zhì)的組成、分子結(jié)構(gòu)等均未進(jìn)行研究。同時(shí)如果能夠?qū)Πl(fā)酵過程中產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的中間代謝產(chǎn)物、關(guān)鍵酶等進(jìn)行調(diào)控，或者將菌種進(jìn)行基因改造，將有望獲得更高的抑菌活性，這對(duì)拮抗菌劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用具有重大意義。