賀安娜+伍賢進(jìn)+李勝華+楊曦

摘要：以虎耳草的春葉和秋葉為材料，比較兩者光合作用與有效成分含量差異，為虎耳草采收利用提供依據(jù)。結(jié)果表明：春葉和秋葉的凈光合速率及蒸騰速率日變量均呈雙峰曲線，上午10：00達(dá)最高，13：00出現(xiàn)“午休”，光合速率的降低受非氣孔因子限制；春葉與秋葉光誘導(dǎo)的時(shí)間一致；高溫對葉片凈光合速率影響很大，秋葉在30℃以上凈光合速率降低更明顯；秋葉的F_v/F_m、F_v/F₀、q_P、Φ_PSⅡ和ETR值都比春葉的顯著或極顯著升高，q_N值顯著降低。秋葉具有更強(qiáng)的光合能力，但秋葉巖白菜素和沒食子酸含量極顯著低于春葉。

關(guān)鍵詞：虎耳草；葉齡；光合特性；有效成分

中圖分類號：Q945.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0224—04

虎耳草為虎耳草科多年生草本植物，生于林緣、巖坡石隙，廣泛分布于我國各地，全草人藥，可消炎、解毒，民間常用于治療中耳炎等病癥。由于株葉優(yōu)美，葉似虎耳，現(xiàn)多作為綠化植物栽培?；⒍葜袔r白菜素含量很高，該類成分已被《中國藥典》收錄，具有止咳、抗炎的功效，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，虎耳草中所含的沒食子酸有抑制前列腺癌的作用，有關(guān)虎耳草有效成分及藥理藥效的研究逐步增多。

光合作用是植物的重要生理活動，它對環(huán)境的變化很敏感，單一環(huán)境因子及多因子綜合作用對光合作用的影響，以及逆境條件下光合作用的變化已有大量的研究報(bào)道，以往的研究也發(fā)現(xiàn)同種植物不同葉齡的光合速率存在較大差異。虎耳草屬典型的陰生植物，經(jīng)過炎熱強(qiáng)光的夏季，植株發(fā)生了很大變化。作者所在課題組在之前的研究發(fā)現(xiàn)，虎耳草在春季光合速率最高，有效成分含量則在冬季最高，但相關(guān)性研究表明，虎耳草中巖白菜素和沒食子酸含量在室溫和強(qiáng)光下積累較多，光合速率與有效成分含量呈顯著正相關(guān)。有研究表明，植物不同葉齡的有效成分含量存在較大差異，基于以往研究，初步判斷造成這種差異的原因是虎耳草葉齡的差異。本研究通過對虎耳草春葉和秋葉的光合特性及有效成分含量進(jìn)行比較，旨在了解虎耳草光合作用及有效成分積累的特點(diǎn)，為虎耳草的采收和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

巖白菜素對照品和沒食子酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所），經(jīng)檢查純度為98%以上。甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑為分析純。

供試材料虎耳草為懷化學(xué)院生物園內(nèi)栽培種，2012年及2013年3月選長勢良好的植株進(jìn)行盆栽，每盆種植3株，共15盆。栽培用的塑料盆上口徑為22 cm，底部直徑15cm，高20cm。置于湖南懷化學(xué)院生物園陰棚內(nèi)（前期試驗(yàn)證明覆蓋1層遮陽網(wǎng)是最適光照），噴頭常規(guī)灑水。分別于2012年、2013年4月和9月對新長出的葉片進(jìn)行掛牌標(biāo)記。

1.6.2色譜條件使用LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）進(jìn)行測定，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C₁₈（150 mm×4.6 nm，5 μm）。流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（73：29）；流速：1.02 mL/min；檢測波長272 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg和沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，以甲醇溶解制成濃度為1.00 mg/mL的溶液，再使用移液槍將其濃度分別稀釋為0.100 0、0.080 0、0.060 0、0.040 0、0.020 0 mg/mL，經(jīng)0.22 μm針孔濾膜過濾，置于超聲波洗凈的離心管中。按色譜條件進(jìn)樣測定，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；厥章试囼?yàn)中精密稱定已知含量的虎耳草約0.50 g，分別加入適量的巖白菜素和沒食子酸對照品，按供試品的制備的步驟提取。

1.6.4虎耳草葉中巖白菜素及沒食子酸含量的測定 取虎耳草葉片干樣1.0 g，按“1.6.3”節(jié)的方法準(zhǔn)備，進(jìn)樣量20 μL。按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算巖白菜素和沒食子酸的含量。

1.7數(shù)據(jù)分析

所測定結(jié)果取平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，利用SPSS及Excel統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析與繪圖。春葉和秋葉的生理生態(tài)差異采用t測驗(yàn)進(jìn)行比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1虎耳草春葉與秋葉的氣體交換日變量

自然條件下，供試材料的凈光合速率和蒸騰速率呈雙峰曲線（圖1），上午10：00達(dá)最高，13：00出現(xiàn)“午休”，下午14：30稍有回升，但仍低于上午。一天當(dāng)中，春葉的凈光合速率和蒸騰速率均略低于秋葉，春葉和秋葉日平均值差異顯著（表1），其中凈光合速率值差異極顯著。

氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度則在上午08：30最高，隨著時(shí)間的推移越來越低，在中午13：00—14：30降至最低點(diǎn)，午后又有所回升。春葉的氣孔導(dǎo)度除了14：30外，都要低于秋葉。而一天中春葉的胞間二氧化碳濃度值除14：30外都略高于秋葉。秋葉的水分利用率、氣孔導(dǎo)度日平均值都極顯著高于春葉，春葉和秋葉胞間二氧化碳濃度差異不顯著。

判斷葉片光合速率降低的主要原因是氣孔限制還是非氣孔限制，一般只根據(jù)胞間二氧化碳濃度的變化方向便可作出正確判斷，胞間二氧化碳濃度降低表明氣孔導(dǎo)度降低是主要因素。10：00—13：00，虎耳草葉片氣孔關(guān)閉，引起胞問二氧化碳濃度降低，從而導(dǎo)致凈光合速率降低。但早上08：30，氣孔導(dǎo)度和胞問二氧化碳濃度都最高，凈光合速率和蒸騰速率并未達(dá)最高，下午14：30以后凈光合速率和蒸騰速率越來越低，氣孔導(dǎo)度和胞間二氧化碳濃度卻有所升高，說明影響虎耳草葉片光合速率的不盡是氣孔因子。

2.2春葉與秋葉光誘導(dǎo)時(shí)間的比較

植物光合作用對光的響應(yīng)不是立即發(fā)生的，需要經(jīng)過一個(gè)光誘導(dǎo)過程，不同的植物、同種植物不同的光處理，光合作用誘導(dǎo)期的長短差別很大。從圖2可知，虎耳草春葉和秋葉凈光合速率在5 min時(shí)差別不大，隨著時(shí)間推移兩者凈光合速率逐步上升，至25 min后基本持平，兩者光誘導(dǎo)所需的時(shí)間一致，秋葉凈光合速率高于春葉。

2.5春葉和秋葉重要有效成分含量比較

虎耳草中沒食子酸和巖白菜素的保留時(shí)間分別為5.15 min和7.99 min（圖4），理論板數(shù)均不低于3 000。

巖白菜素和沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表3，兩者的相關(guān)系數(shù)均達(dá)0.999以上，回收率也可達(dá)98%以上。

虎耳草中重要有效成分含量測定發(fā)現(xiàn)，虎耳草葉中巖白菜素含量高于沒食子酸（表4），春葉的沒食子酸和巖白菜素含量分別為1.52、4.82 mg/g，均極顯著高于秋葉。

3討論

植物因素如葉片氣孔導(dǎo)度、氣孔阻力等是植物長期適應(yīng)多變的環(huán)境和土壤而形成的一類自身調(diào)節(jié)因素，主要通過環(huán)境因子和土壤水分狀況而間接影響植物的光合生理變化。從本研究來看，虎耳草葉片的凈光合速率和蒸騰速率呈雙峰曲線，上午10：00達(dá)最高，13：00出現(xiàn)“午休”，10：00至13：00氣孔導(dǎo)度也逐步降低，因此這段時(shí)間凈光合速率主要受氣孔因素影響；午后氣孔導(dǎo)度有所回升，凈光合速率卻進(jìn)一步下降，導(dǎo)致胞問二氧化碳濃度的緩慢升高，此時(shí)凈光合速率受非氣孔因子限制。通過光誘導(dǎo)曲線和溫度響應(yīng)曲線可發(fā)現(xiàn)，不同虎耳草葉齡光誘導(dǎo)所需的時(shí)間一致，說明不同葉齡對光的敏感程度是一致的；短時(shí)的低溫對光合速率影響不大，此時(shí)光合速率有關(guān)的酶活性并沒有受太多影響，這是虎耳草適應(yīng)低溫環(huán)境了一種表現(xiàn)；高溫對光合速率有負(fù)面影響，其中新長出的秋葉受影響更明顯。

藥用植物有效成分含量在不同的季節(jié)存在較大差異。蘇春花等研究發(fā)現(xiàn)，闊葉箬竹冬季總黃酮含量最高，可溶性糖以春季最多，這與次生代謝產(chǎn)物合成的途徑不同有關(guān)?；⒍莨夂纤俾逝c有效成分含量呈顯著正相關(guān)，但本研究發(fā)現(xiàn)光合速率高的秋葉，巖白菜素等有效成分含量顯著低于光合速率低的春葉，這應(yīng)該與巖白菜素、沒食子酸代謝途徑有關(guān)，葉齡長有利于此類次生代謝產(chǎn)物的積累。虎耳草春葉有較厚的表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞，秋葉柵海比則高，巖白菜素與沒食子酸合成積累在葉片中的組織化學(xué)定位值得進(jìn)一步研究。

虎耳草在春季和秋季均有旺盛生長期，夏季的高溫和強(qiáng)光、冬季的低溫可導(dǎo)致虎耳草半休眠。綜合上述，種植虎耳草應(yīng)抓緊春、秋兩季的生長期，給予充足的肥水條件，采收則應(yīng)在夏冬2季進(jìn)行。