王夏　孫菲菲　酈月紅　王強(qiáng)　孫雪花　劉慶葉

摘要：利用優(yōu)良二倍體不結(jié)球白菜華鳳為試驗(yàn)材料，采用秋水仙素活體誘導(dǎo)其生長點(diǎn)，旨在創(chuàng)建同源四倍體種質(zhì)。通過形態(tài)學(xué)比較、流式細(xì)胞儀測定遺傳物質(zhì)含量等方法鑒定了變異植株倍性，從中篩選獲得了同源四倍體。在此基礎(chǔ)上，選取3個(gè)優(yōu)異同源四倍體自交系為研究對象，發(fā)現(xiàn)四倍體的營養(yǎng)品質(zhì)提高，花期延長約10 d，結(jié)實(shí)率達(dá)到了應(yīng)用的水平。研究結(jié)果表明，不結(jié)球白菜同源四倍體種質(zhì)具有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：不結(jié)球白菜；同源四倍體；秋水仙素；種質(zhì)創(chuàng)新

中圖分類號：S634.302 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0173—03

不結(jié)球白菜別稱青菜、小白菜，是我國廣泛種植的蔬菜種類，如今正逐漸成為世界性蔬菜。不結(jié)球白菜營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、生長快速、易種植，特別適合作為穩(wěn)定蔬菜價(jià)格的“杠桿”類蔬菜種植。因此選育耐熱耐抽薹的不結(jié)球白菜新品種具有促進(jìn)不結(jié)球白菜生產(chǎn)的意義，而多倍體獨(dú)特的基因劑量效應(yīng)促使多倍體在抗逆性上具有更強(qiáng)的優(yōu)勢，目前在不結(jié)球白菜新品種選育中已經(jīng)有所應(yīng)用，四倍體矮腳黃、熱優(yōu)2號等品種已經(jīng)走向市場。四倍體不結(jié)球白菜通常具有植株個(gè)體增大、營養(yǎng)價(jià)值提高、抗逆性增強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是具有多倍體常見的育性下降、制種產(chǎn)量低等不足，如1個(gè)成熟的四倍體往往需要經(jīng)過6～7代的馴化，才能基本達(dá)到生產(chǎn)應(yīng)用的水平。因此，我們認(rèn)為將四倍體作為新的種質(zhì)資源，利用多倍體在基因突變、遠(yuǎn)緣雜交、固定雜種優(yōu)勢等方面的特點(diǎn)更加有效。本研究利用已有的技術(shù)手段，通過綜合應(yīng)用，將為不結(jié)球白菜異源四倍體種質(zhì)創(chuàng)新構(gòu)建高效的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為二倍體青梗菜品種華鳳，由廣州農(nóng)鑫農(nóng)業(yè)科技有限公司銷售。四倍體矮腳黃由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。試驗(yàn)于2012年9月20日至2014年5月26日在南京市蔬菜科學(xué)研究所橫溪蔬菜科技園進(jìn)行。

1.2四倍體誘導(dǎo)

2012年9月20日穴盤育苗200株，出苗后問苗、齊苗。待子葉展開，尚未破心之前用0.2%秋水仙素溶液點(diǎn)滴生長點(diǎn)，每次20μL，每天上、下午各處理1次，處理2 d。

1.3四倍體鑒定篩選方法

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定的原則是肉眼可見，主要包括葉形、葉色、花器官、角果、種子等。在形態(tài)學(xué)鑒定篩選過程中，將可疑株一律拔除。

1.3.2群體篩選 2013年9月25日，將一代自交種子按單株播種，調(diào)查群體的一致性。嵌合體在加倍過程中普遍存在，雖然通過形態(tài)學(xué)鑒定之后，部分被淘汰，但不一定完全。因此，在群體調(diào)查過程中，淘汰具有明顯分離現(xiàn)象的群體。

1.3.3流式細(xì)胞儀倍性分析 流式細(xì)胞儀分析法可迅速測定細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量和細(xì)胞核的大小，是大范圍鑒定倍性快速有效的方法。測定由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)協(xié)助完成，方法參照文獻(xiàn)[4]。每個(gè)群體隨機(jī)抽取5株進(jìn)行測定，以二倍體為對照。

1.4四倍體留種

對鑒定為四倍體的誘變植株M₀代，進(jìn)行嚴(yán)格的單株蕾期人工授粉。2013年5月單株收種M₁代并統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率，同年9月選擇結(jié)實(shí)性高的單株播種，每株系自成小區(qū)。從葉柄寬、厚，葉色亮綠、束腰緊湊的株系中篩選優(yōu)質(zhì)單株嚴(yán)格自交留種，統(tǒng)計(jì)單株結(jié)實(shí)率（結(jié)實(shí)率=結(jié)籽數(shù)/角果數(shù)）。2013年9月重復(fù)上述步驟，收獲M₂代自交種。M₁、M₂代小區(qū)試驗(yàn)面積3 m×2 m，定植數(shù)量80棵，10月下旬定植，12月中下旬采收。

1.5四倍體營養(yǎng)品質(zhì)調(diào)查

2013年11月5日選取標(biāo)準(zhǔn)棵菜進(jìn)行測定，葉片和葉柄2個(gè)部位分開進(jìn)行，3次重復(fù)，測定樣品選取部位一致。營養(yǎng)品質(zhì)測定的指標(biāo)有可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、硝態(tài)氮含量、維生素C含量、粗纖維含量。考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測蛋白質(zhì)含量；蒽酮-硫酸比色法測定可溶性糖含量；水楊酸比色法測定硝態(tài)氮含量；液相色譜法測定維生素C含量；粗纖維含量測定參考康琪等的方法。數(shù)據(jù)使用Excel分析。

1.6四倍體育性調(diào)查

2014年春季觀察四倍體花期情況并單株套袋自交留種，以四倍體矮腳黃為對照。

2結(jié)果與分析

2.1多重篩選的效果

受低溫影響，200株處理植株中15%死亡，30%的植株受凍害影響嚴(yán)重，生長緩慢，營養(yǎng)生長積累不足，但對照生長正常。形態(tài)學(xué)鑒定過程中淘汰30%植株，主要是疑似嵌合體和畸形體。套袋自交之后，結(jié)籽單株44株，占總處理的22%，其中種子數(shù)量超過25粒的28株，占總處理的14%；種子數(shù)量超過50粒的16株，占總處理的8%；種子數(shù)量超過100粒的3株，占總處理的1.5%。將種子量達(dá)到50粒的播種育苗定植，其中無分離群體10個(gè)，挑選了其中3個(gè)群體進(jìn)行抽樣調(diào)查，進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較和流式細(xì)胞儀分析。

2.2二倍體、四倍體形態(tài)學(xué)比較

四倍體在不同生長時(shí)期形態(tài)上的變化很多，特征典型，這也是四倍體篩選的重要一步。相對于二倍體，四倍體的葉片肥厚、色澤加深、花朵變大、果莢變小、種子增大（圖1）。

2.3流體細(xì)胞儀倍性分析

在多重篩選的基礎(chǔ)之上，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示來自3個(gè)群體的15株植株都是四倍體。圖2中縱坐標(biāo)Count值代表測定細(xì)胞數(shù)的相對值，橫坐標(biāo)FL3值代表熒光的通道值，峰值的位置反映的是測試樣品的倍性。雜合二倍體DNA相對含量在80和180附近，疑似株DNA相對含量在160和360附近，約是對照的2倍，表明是四倍體。因此，通過對雜交小白菜品種華鳳的加倍，成功創(chuàng)建了新的異源四倍體種質(zhì)，命名4X。

2.4二倍體、四倍體品質(zhì)調(diào)查

四倍體不結(jié)球白菜品質(zhì)優(yōu)于二倍體，其中四倍體葉柄部分比二倍體葉柄部分的可溶性糖含量增加11.35%，差異極顯著；維生素C含量增加28.57%，差異不顯著；硝酸鹽含量降低11.64%，差異不顯著；可溶性蛋白質(zhì)含量增加75%，差異極顯著；粗纖維含量降低31%，差異顯著。四倍體葉片部分比二倍體葉片部分的可溶性糖含量增加40.74%，差異顯著；維生素c含量增加53.15%，差異顯著；硝酸鹽含量降低10.16%，差異不顯著；可溶性蛋白質(zhì)含量增加27.48%，差異顯著；粗纖維含量降低27.31%，差異極顯著（表1），這與鄧云等的研究結(jié)果相似。

2.5異源四倍體花期與結(jié)實(shí)率調(diào)查

田間觀察比較發(fā)現(xiàn)，四倍體與二倍體F₁的始花期基本一致，但四倍體3個(gè)姊妹系的花期比二倍體長10 d左右。四倍體不同單株之間結(jié)實(shí)率有差異，但與四倍體矮腳黃對比，結(jié)籽情況相似。

3討論

蔬菜多倍體育種是蔬菜育種的一條重要途徑。多倍體育種在不結(jié)球白菜品種選育中取得了巨大的成果，但已報(bào)道的不結(jié)球白菜加倍處理多利用自交系材料，本研究中利用F₁雜合體進(jìn)行加倍，形成同源四倍體是一種新的嘗試。采用雜合體進(jìn)行加倍，能夠快速聚集親本的優(yōu)良性狀，保證了四倍體種質(zhì)價(jià)值的同時(shí)縮短了時(shí)間。另外，F(xiàn)₁雜合體比多世代自交系具有更強(qiáng)的生長勢，實(shí)際生長中的一致性更容易體現(xiàn)，對材料中的二倍體雜株和異常株的剔除相對更加容易，但是高純度的F₁雜合體種子的獲取難度相對較大，尤其是手工配制產(chǎn)生的F₁材料，需要高純度的自交系親本和人工剝蕾雜交，收集的種子除了加倍試驗(yàn)，還需要考慮多代的對照材料問題。

加倍之后的四倍體鑒定篩選是四倍體種質(zhì)創(chuàng)新的關(guān)鍵，通常包括形態(tài)學(xué)比較、染色體計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞儀分析等。二倍體加倍之后，由于基因劑量效應(yīng)，植株器官發(fā)生變化，抗逆性能夠增強(qiáng)，而形態(tài)學(xué)比較及逆境脅迫篩選是在此基礎(chǔ)之上的合理運(yùn)用，如在西瓜四倍體鑒定中，溫度脅迫篩選的方法鑒定的倍性符合度超過80%。通過比較自然低溫條件下不結(jié)球白菜二倍體與四倍體可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)四倍體比二倍體更加耐寒，這一研究結(jié)果也表明溫度篩選不結(jié)球白菜也是可能的，只是目前不結(jié)球白菜低溫脅迫與四倍體篩選的方法尚不完備，還需進(jìn)一步研究。

不結(jié)球白菜四倍體的育性一般低于二倍體，這是因?yàn)樵谌旧w加倍的過程中，由于基因重復(fù)，基因重組與變異大量發(fā)生，使原有的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生了暫時(shí)的紊亂，而四倍體經(jīng)過多代的馴化，育性往往又能夠進(jìn)一步恢復(fù)。同時(shí)每個(gè)植株在加倍過程中產(chǎn)生的基因重組與變異是不同的，因此我們認(rèn)為在創(chuàng)建四倍體種質(zhì)的過程中，首先需要篩選的是具有較好育性的材料，對四倍體初代開始通過套袋自交、輔助傳粉的處理手段，在一種苛刻的選擇條件下篩選適合的育種材料，既減少了工作量，也有助于得到育性較好的個(gè)體，為四倍體種質(zhì)資源的利用打下基礎(chǔ)。在此研究中得到的四倍體材料具有營養(yǎng)品質(zhì)提高、花期延長、結(jié)實(shí)率較高等特點(diǎn)，作為育種材料將具有良好的應(yīng)用前景。