劉碧霞　　章紅燕

[摘要] 目的 探討姜黃素對 H22肝癌、S180肉瘤小鼠的抑瘤作用及機制，為H22肝癌臨床治療提供實驗依據(jù)。方法 采用ICR小鼠接種H22瘤株、S180肉瘤株分別建立腫瘤模型，采用姜黃素進行干預，明確其抑瘤作用，分陽性對照組（CTX化療組）、陰性對照組（生理鹽水組）、姜黃素低劑量組、姜黃素中劑量組、姜黃素高劑量組，每組12只。對比分析治療組各組用藥前后體重、抑瘤率的差異；動物處死后，取腫瘤組織，采用熒光定量RT-PCR測定腫瘤組織中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達。 結(jié)果 姜黃素對肝癌和肉瘤小鼠腫瘤生長抑制率為36.04%和41.27%，有明顯的抑瘤作用。與模型組比較，給藥組腫瘤組織NF-κB、CyclinD1、VEGF的表達水平下調(diào)，TGF-β1RⅡ的表達水平顯著升高。 結(jié)論 姜黃素通過上調(diào)腫瘤組織TGF-β1RⅡ，下調(diào)NF-κB、CyclinD1、VEGF表

肝癌是我國高發(fā)的、危害極大的惡性腫瘤。原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，PLC）的病因及分子機制尚不完全清楚，目前認為其發(fā)病是復雜過程。近年來傳統(tǒng)中醫(yī)中藥在肝癌綜合治療中有明顯優(yōu)勢[1-3]。中醫(yī)藥治療與手術(shù)、放療、化療、免疫治療一道被稱為當前針對惡性腫瘤的五大類治療。近幾年來，從中藥中尋找結(jié)構(gòu)新穎和作用獨特的抗腫瘤活性成分或先導化合物是抗腫瘤藥物研究的一條重要途徑。目前上市的抗腫瘤藥很多來源于中藥的提取及開發(fā)，包括紫杉來源的紫杉醇、多西紫杉醇，三尖杉來源的高三尖杉酯堿，人參來源的人參皂甙 Rg3 等。

姜黃，又名黃姜、郁金、寶鼎香，為姜科植物姜黃的根莖，主產(chǎn)于浙江、福建、湖北、四川等地，為浙江省重要的本土中藥材。藥理研究表明，姜黃具有保肝、利膽、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗艾滋病、抗生育、降血脂、抗病原微生物及抗病原蟲、加快創(chuàng)傷愈合、抗突變等作用。姜黃素主要是從姜科植物郁金中提取的一種化合物[4]。1985年Kuttan等[5]首次提出姜黃素具有抗腫瘤的作用，此后有大量研究進一步證實。吉鴻等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃主要提取物姜黃素可通過抑制NF-γB-Snail信號途徑來抑制乳腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（EMT），進而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力。范德生等[7]發(fā)現(xiàn)用姜黃素處理鼻咽癌細胞系CNE-2Z后，腫瘤細胞增殖明顯受到抑制，同時細胞的侵襲和遷移能力明顯降低，其機制可能與姜黃素下調(diào)EGFR的表達有關(guān)。宛傳丹等[8]發(fā)現(xiàn)姜黃素可有效抑制肝癌細胞的增殖，并可進一步誘導細胞凋亡。劉鵬等[9]通過對免疫抑制小鼠實驗，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬指數(shù)，增加B細胞抗體產(chǎn)生能力，增強免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增值，對固有免疫和適應免疫均有一定的增強作用。李然等[10]在藥物毒性角度證實其安全性。介于其良好的安全性及廣泛的抗腫瘤作用，本研究探討其抗肝癌作用及具體的分子機制。

1 材料與方法

1.1一般材料

1.1.1 細胞株及培養(yǎng) S180瘤株、人肝癌HepG2細胞株引自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，將H22肝癌細胞株，S180瘤株接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿中，加培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行研究。

1.1.2 動物 ICR小鼠，SPF級，年齡：4～6周，體重18～22 g。浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，由常州卡文斯生物科技發(fā)展有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2011-0003；實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2011-0036。

1.1.3 藥物 姜黃素購自Sigma公司，分子質(zhì)量368.38，以二甲基亞楓（DMSO）溶解，配制成100 mmol/L儲存液，使用時用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，稀釋后的DMSO終質(zhì)量分數(shù)<5%，置于-20℃避光保存。注射用環(huán)磷酰胺：200 mg/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.4 主要儀器 生物倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51）；臺式低速離心機（中國上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療設備廠80-2）；PCR儀器（美國ABI公司 9700型）。

1.2 實驗方法

1.2.1 H22肝癌小鼠模型制備與分組 收集培養(yǎng)的人肝癌細胞HepG-2懸液，濃度為1×107個/mL，以每只0.1 mL接種于60只體重（20±2）g ICR小鼠右側(cè)腋窩皮下。接種后隨機分為陰性對照組、姜黃素低劑量組（10 μmol/L）、姜黃素中劑量組（20 μmol/L）、姜黃素高劑量組（40 μmol/L）、陽性對照組、每組12只。

1.2.2 S180肉瘤小鼠模型制備與分組 取雄性60只ICR小鼠。無菌條件下取接種S180瘤株6～7 d的小鼠的腹水，以生理鹽水稀釋，調(diào)細胞濃度至1×107個/mL。按0.2 mL每只接種于小鼠前肢右腋皮下。接種后隨機分為陰性對照組、姜黃素低劑量組（10 μmol/L）、姜黃素中劑量組（20 μmol/L）、姜黃素高劑量組（40 μmol/L）、陽性對照組（CTX組），每組12只。

1.2.3 給藥 接種24 h后，陰性對照組灌胃生理鹽水，劑量為0.2 mL/10 g，每天1次；姜黃素低、中、高濃度組分別給予10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L， 給藥劑量0.2 mL/10 g，每天1次；陽性對照組腹腔注射CTX，20 mg/kg，每天1次。觀察14 d停藥，稱重，處死并剝離皮下瘤體稱重。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集 使用測量瘤徑的方法，動態(tài)觀察受試樣品的抗腫瘤效應。給藥前各組鼠稱重（第1次），并在給藥2周后分別稱重，給藥結(jié)束后，處死，手術(shù)剝?nèi)×鰤K稱重。

1.2.5 抑瘤研究 抗腫瘤活性的評價指標：腫瘤生長抑制率（%），計算公式如下：

1.2.6 熒光定量RT-PCR測定腫瘤組織中TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達的影響 （1）腫瘤組織總mRNA提取：按常規(guī)進行。（2）逆轉(zhuǎn)錄反應：按試劑盒說明操作進行。反應條件：37℃ 60 min，95℃ 3 min。（3）實時熒光定量PCR擴增：按試劑盒說明操作進行。反應條件：93℃→3 min變性，然后按93℃ 45 s→55℃ 60 s，共做40個循環(huán)。（4）PCR引物序列設計。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS（Staffstical Package for the Social Science）19.0對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對荷H22肝癌瘤小鼠的抑瘤作用

姜黃素低、中、高劑量組對肝癌的腫瘤抑制率分別為12.15%、36.04%、19.84%、以中劑量組抑瘤作用最好，陽性對照組的腫瘤抑制率48.99%。姜黃素低、中、高劑量組和陽性對照組與陰性對照組瘤重相比均有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果顯示姜黃素對荷H22肝癌小鼠的腫瘤生長都有明顯的抑制作用，見表1，圖1。

2.2 姜黃素對荷S180肉瘤小鼠的抑瘤作用

與陰性對照組比較，姜黃素對荷S180肉瘤小鼠的腫瘤生長都有明顯的抑制作用，其中低、中、高劑量組的抑瘤率分別為34.13%、41.27%、22.23%，給藥組以中劑量抑瘤作用最好，CTX化療組的抑瘤率55.56%。與陰性對照組相比，姜黃素低、中劑量組瘤重，均有顯著差異（P<0.05）；CTX組的瘤重有非常顯著差異（P<0.01）。見表2，圖1。

2.3熒光定量結(jié)果

2.3.1 TGF-β1RⅡ熒光定量結(jié)果 與陰性對照組比較，中、高劑量姜黃素組和CTX組的TGF-β1RⅡ的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；低劑量組TGF-β1RⅡ的表達水平略高，但無顯著性差異；與CTX化療組比較，中、高劑量姜黃素組和CTX組的TGF-β1RⅡ表達水平顯著升高。

2.3.2 NF-κB熒光定量結(jié)果 與生理鹽水比較，低、中、高劑量姜黃素組和陽性對照組（CTX）NF-κB的表達水平均有明顯降低，且均有顯著差異（P<0.01），其中以高劑量的姜黃素組降低水平最為明顯。與CTX化療組相比，高劑量組更有明顯的療效趨勢，結(jié)果有顯著性差異（P<0.01）。見表4。

2.3.3 VEGF熒光定量結(jié)果 與陰性對照組比較（生理鹽水），低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組（CTX）VEGF的表達水平有明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）；與CTX化療組相比，高劑量組無顯著性差異（P>0.05），見表5。

2.3.4 CyclinD1熒光定量結(jié)果 與陰性對照組相比，高劑量組差異非常顯著（P<0.01）；與陰性對照組相比，低劑量組、中劑量組和CTX化療組有顯著差（P<0.05）。見表6。

3討論

姜黃素是從中藥姜黃、郁金、莪術(shù)、菖蒲等植物的根莖中提取的一種天然黃色酚類色素，其抗腫瘤效應近年來備受關(guān)注，有研究證實姜黃素有確切的抗腫瘤、抗氧化、抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成等作用[11]。姜黃素因其廣泛的藥理作用，在中國的傳統(tǒng)醫(yī)學中被廣泛應用；而在現(xiàn)代醫(yī)學中，姜黃素儼然成為研究的熱點。因其誘導細胞凋亡、抑制腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的抗癌作用和逆轉(zhuǎn)耐藥性，且毒副作用小、安全性高[12-16]，因此姜黃素是一種具有前景的抗癌藥物，但其抗癌作用的更具體的機制需進一步研究。目前已發(fā)現(xiàn)姜黃素對多種惡性腫瘤如乳腺癌、宮頸癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌、胃癌[17]等均有抑制生長的作 用，美國國立腫瘤所已將其列為第三代癌化學預防藥[18，19]，但其作用機制及療效還需進一步研究證實。大量研究證明姜黃素具有廣泛的生理活性作用，不但能保護受損的正常細胞，也能抑制腫瘤細胞的增殖，在抗腫瘤藥物中比較有發(fā)展前景，但其療效因口服吸收率低而受到限制[20-21]。這就要求我們也要不斷發(fā)現(xiàn)姜黃素中更易于吸收、更有效的成分。相信在未來的研究中，通過聯(lián)合藥物治療、基因治療、分子靶向治療可進一步提高惡性腫瘤治療水平。

本項目通過姜黃素干預移植瘤模型，進行體內(nèi)抑瘤作用研究；采PCR檢測腫瘤組織TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達的水平。本研究完成了既定的研究內(nèi)容，取得了預期的研究成果：①明確姜黃素對H22肝癌、S180肉瘤荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用研究；②明確姜黃素對H22肝癌腹水瘤小鼠的生存時間的延長作用；③明確姜黃素對腫瘤組織TGF-β1RⅡ、NF-κB、CyclinD1、VEGF表達影響。

國內(nèi)外在抗腫瘤藥物篩選過程中通常選擇各種體型實腫瘤，這類腫瘤生長速度快，增殖比率高，體積倍增時間短。腫瘤體積和腫瘤體重是評價藥物抗腫瘤活性的重要指標，給藥后，各組小鼠腫瘤持續(xù)增長。給藥一周后給藥組與CTX組比較，出現(xiàn)顯著性差異（P<0.01）。

根據(jù)國家新藥研究規(guī)定，當抑制率>30%，差異有統(tǒng)計學意義，則評定該受試藥物有一定的抗胖瘤活性，可見，本研究的姜黃素具有良好的抗肝癌異種移植瘤活性。

腫瘤的生長過程中，機體內(nèi)血液對營養(yǎng)的供給能力是影響腫瘤生長以及荷瘤機體維持正常生理功能的中藥影響因素。紅細胞是外周血中起到運送氧氣和二氧化碳的作用，血紅蛋白是紅細胞中結(jié)合氧氣和二氧化碳的活性成分，白細胞在機體中起到防御和免疫功能，淋巴細胞占白細胞的20%～30%，分為T細胞、B細胞、NK細胞等不同類型，分別起到細胞免疫和體液免疫功能，血小板在機體的炎癥過程中起到一定作用。血相的變化可以在一定意義上反映機體功能是否正常。本實驗后續(xù)還將進一步開展研究姜黃素對移植瘤小鼠的脾臟和血小板、血紅蛋白、淋巴細胞等血細胞的影響，評價抗癌扶正協(xié)定方對機體的不良反應，此外，還從增效減毒角度探討姜黃素是否具備逆轉(zhuǎn)或緩解CTX等化療藥物的骨髓抑制，減少化療藥物對機體的損傷作用。

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（收稿日期：2016-12-06）