方 波，張 穎，馬 虹

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110001)

miR-122a 對大鼠脊髓缺血/再灌注損傷后血-脊髓屏障的影響

方 波，張 穎，馬 虹

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉科，遼寧 沈陽 110001)

目的 探討miR-122a對脊髓缺血/再灌注損傷后血-脊髓屏障的影響。方法 SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(S組)、對照組(C組)、miR-122a反義寡核苷酸(miR-122a antagomir)組(M組)。S組開胸游離主動脈弓，但不阻斷；C組和M組開胸阻斷主動脈弓14 min造成脊髓缺血/再灌注損傷。M組和C組脊髓缺血/再灌注損傷后，鞘內(nèi)注射miR-122a antagomir或空白對照，每日1次，共3次。Real-time PCR測定損傷節(jié)段脊髓組織的miR-122a表達(dá)，Western blot測定脊髓組織中緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)，伊文思藍(lán)測定血-脊髓屏障通透性，Basso Beattie Bresnahan評分法評價神經(jīng)運動功能。結(jié)果 與S組比較，C組miR-122a表達(dá)增加，occludin表達(dá)減少，血-脊髓屏障通透性增加，神經(jīng)運動功能評分降低(P<0.05)。與C組比較，M組miR-122a表達(dá)降低，occludin表達(dá)增加，血-脊髓屏障通透性降低，神經(jīng)運動功能評分增加(P<0.05)。結(jié)論 miR-122a參與調(diào)控脊髓缺血/再灌注損傷后occludin表達(dá)，影響血-脊髓屏障通透性。

缺血/再灌注損傷；脊髓；血-脊髓屏障；miR-122a；緊密連接蛋白；occludin

脊髓缺血/再灌注損傷是胸腹主動脈瘤手術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是急需攻克的難題。血-脊髓屏障破壞是脊髓損傷的重要繼發(fā)病理改變，而且進(jìn)一步加重脊髓損傷[1]。MicroRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，是目前研究基因治療和尋找藥物靶點的重要工具。最近研究證實，miR-122a介導(dǎo)緊密連接蛋白o(hù)ccludin 的mRNA降解增加腸道通透性[2-3]。有關(guān)miR-122a在脊髓損傷中的作用及可能的機(jī)制目前尚不清楚。本研究擬探討miR-122a對脊髓缺血/再灌注損傷后血-脊髓屏障的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物選擇與分組 SD大鼠36只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量200～250 g。采用隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)分為3組(n=12)：假手術(shù)組(S組)、對照組(C組)、miR-122a反義寡核苷酸(miR-122a antagomir)組(M組)。S組開胸游離主動脈弓，但不阻斷；C組和M組開胸阻斷主動脈弓14 min造成脊髓缺血/再灌注損傷。M組和C組在脊髓缺血/再灌注損傷后30 min鞘內(nèi)注射20 μL miR-122a antagomir(20 μmol·L-1，廣州銳博公司)，每日注射1次，共3次。C組脊髓缺血/再灌注損傷后鞘內(nèi)注射等量miR-122a antagomir空白對照。實驗室光照時間6 ∶00～18 ∶00，溫度控制在18℃～22℃，造模后分籠飼養(yǎng)，保證充足的水和食物。

1.2 脊髓缺血/再灌注損傷模型的建立 大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，經(jīng)氣管切開處行氣管內(nèi)插管機(jī)械通氣。直腸內(nèi)置入溫度傳感器，持續(xù)監(jiān)測體溫，應(yīng)用電熱毯維持核心溫度(37.5±0.5) ℃。脊髓缺血/再灌注損傷模型參照文獻(xiàn)[4]制備。左頸總動脈置管測量近端動脈血壓，尾動脈置管測量遠(yuǎn)端血壓。擺右側(cè)臥位，于左前肢和肩胛下角間行橫切口，逐層分離暴露肋骨，于第2、3肋之間暴露胸腔，分離并顯露主動脈弓。皮下注射肝素(200 IU·kg-1)，于左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間夾閉主動脈，阻斷14 min后開放動脈夾，造成脊髓缺血/再灌注損傷。關(guān)胸，逐層縫合。術(shù)后將動物放置28℃的保溫箱內(nèi)，等待動物蘇醒后回籠飼養(yǎng)。

1.3 Real-time PCR 脊髓缺血/再灌注損傷后72 h，取新鮮缺血節(jié)段脊髓組織，根據(jù)TRIzol操作說明，提取細(xì)胞總RNA。提取的總RNA定量后，對于蛋白編碼基因使用Oligo(dT)作為逆轉(zhuǎn)錄引物，對于miRNA使用miRNA特異的逆轉(zhuǎn)錄引物，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板，MX3000P Real-time PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，SYBR染料實時檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量，以GAPDH為內(nèi)參分析蛋白編碼基因表達(dá)情況，以U6 為內(nèi)參分析miRNA的表達(dá)情況。所使用引物序列如下：U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，GAPDH下游引物5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′。

1.4 Western blot 脊髓缺血/再灌注損傷后72 h，取新鮮缺血節(jié)段脊髓組織，迅速液氮冷凍保存。標(biāo)本取齊后，剪碎，加組織裂解液，冰上勻漿，4℃離心15 min，取其上清液，BCA法蛋白定量，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、醋酸纖維素膜包被后，加入兔抗大鼠occludin一抗(1 ∶500，Invitrogen公司)，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗，化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對其進(jìn)行半定量分析。

1.5 血-脊髓屏障通透性測定 脊髓缺血/再灌注損傷后72 h，經(jīng)鼠尾靜脈緩慢注射2% 伊文思藍(lán)10 mL·kg-1，1 h后麻醉，經(jīng)左心室灌注生理鹽水500 mL·kg-1，取出脊髓缺血節(jié)段(L4-6)，迅速放入40 g·L-1多聚甲醛中，24 h后依次置于150、200、300 g·L-1的蔗糖中沉糖，沉糖完畢后包埋，冰凍切片，置于熒光顯微鏡綠色激光下觀察。依照熒光光斑的大小、疏密、強(qiáng)弱來評價脊髓組織中伊文思藍(lán)外滲量。

1.6 大鼠神經(jīng)運動功能評價 采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分標(biāo)準(zhǔn)對大鼠下肢運動神經(jīng)功能進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測脊髓組織中miR-122a表達(dá) 與S組(1.00±0.07)相比，C組miR-122a表達(dá)(3.78±0.46)增高(P<0.05)；與C組相比，M組miR-122a表達(dá)(1.74±0.27)降低(P<0.05)，F(xiàn)ig 1。

Fig 1 miR-122a expression at 72 h after spinal

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.2 Western blot 檢測脊髓組織中occludin表達(dá) 與S組(1.00±0.06)相比，C組occludin表達(dá)(0.28±0.04)降低(P<0.05)；與C組相比，M組occludin表達(dá)(0.55±0.06)增加(P<0.05)，F(xiàn)ig 2。

Fig 2 Occludin expression at 72 h after spinal

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.3 血-脊髓屏障通透性 脊髓缺血/再灌注損傷后，血-脊髓屏障破壞，通透性增加，與S組(1.00±0.08)相比，C組伊文思藍(lán)外滲量(6.12±0.73)增加(P<0.05)；與C組相比，M組伊文思藍(lán)外滲量(3.24±0.38)減少(P<0.05)，F(xiàn)ig 3。

Fig 3 Permeability of blood-spinal cord barrier at

A:Evans blue extravasation fluorescence;B:Quantitative analysis of evans blue extravasation.S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

2.4 大鼠神經(jīng)運動功能 與S組(21.0±0.0)比較，C組BBB評分(7.2±1.1)降低(P<0.05)；與 C組比較，M組BBB評分(13.7±2.8)增高(P<0.05)，F(xiàn)ig 4。

S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P<0.05vsS group;#P<0.05vsC group

3 討論

脊髓缺血/再灌注損傷是胸腹主動脈瘤手術(shù)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，可引起脊髓功能障礙，甚至截癱。血-脊髓屏障與血-腦屏障相似，是一個復(fù)雜的細(xì)胞系統(tǒng)，調(diào)節(jié)脊髓液體微環(huán)境在較小的范圍內(nèi)波動，對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著非常重要的作用[5]。脊髓缺血/再灌注損傷后，血-脊髓屏障完整性破壞，通透性增加，造成脊髓組織水腫、炎癥以及神經(jīng)元凋亡，進(jìn)一步加重脊髓損傷[6-9]。緊密連接是血-脊髓屏障的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，occludin是第一個被分離出的組成緊密連接的完整膜蛋白，主要參與微血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接的形成。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓缺血/再灌注損傷后occludin表達(dá)減少，導(dǎo)致血-脊髓屏障通透性增加[10]，但其機(jī)制尚不完全明確。

MicroRNA屬于調(diào)控RNA家族一員。當(dāng)非編碼小RNA與靶mRNA完全或不完全配對時，可引起mRNA降解，或發(fā)生在mRNA水平上誘導(dǎo)特異性序列基因表達(dá)部分或完全抑制的過程[11]。miR-122a作為肝臟特異性高表達(dá)的microRNA，對其研究多集中在肝癌的發(fā)生發(fā)展中[12-13]。最近研究表明，miR-122a也負(fù)向調(diào)控緊密連接蛋白o(hù)ccludin的表達(dá)[2,3,14]，參與內(nèi)皮細(xì)胞通透性調(diào)節(jié)，影響病理生理功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓缺血/再灌注損傷后miR-122a表達(dá)上調(diào)，同時伴隨occludin表達(dá)減少，血-脊髓屏障破壞。反義寡核苷酸在miRNA 功能研究中是沉默miRNA的最常用，且行之有效的方法[15]。本研究鞘內(nèi)注射miR-122a antagomir抑制了miR-122a表達(dá)，而且增加occludin表達(dá)，減輕血-脊髓屏障破壞，改善大鼠神經(jīng)運動功能。

綜上所述，miR-122a在脊髓缺血/再灌注損傷中通過調(diào)控血-脊髓屏障緊密連接蛋白o(hù)ccludin，進(jìn)而發(fā)揮重要的作用。將其作為靶點，將為預(yù)防和治療脊髓損傷提供新思路。

(致謝：本實驗在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗中心、麻醉科實驗室完成，在此特對以上實驗室和實驗過程中給予指導(dǎo)和幫助的老師表示感謝！)

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Effects of miR-122a on blood-spinal cord barrier after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats

FANG Bo，ZHANG Ying，MA Hong
(DeptofAnesthesiology,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China)

Aim To investigate the effects of miR-122a on blood-spinal cord barrier after spinal cord ischemia-reperfusion injury in rats.Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups：group of sham(S group), group of control(C group) and group of miR-122a antagomir(M group). Rats in S group were subjected to exposure of aorta arch but without occlusion. Spinal ischemia-reperfusion injury was induced by clamping the aorta arch for 14 min in C group and M group. Rats in M group and C group were intrathecally injected with miR-122a antagomir or antagomir control daily for three times after injury. The miR-122a expression in injured spinal cord tissue was detected by real-time PCR. The occludin expression in injured spinal cord tissue was detected by Western blot. The permeability of blood-spinal cord barrier was examined using evans blue as a vascular tracer. The neurological motor function was evaluated by Basso Beattie Bresnahan score.Results Compared with S group, the expression of miR-122a was increased, the expression of occludin was decreased, the permeability of blood-spinal cord barrier was increased, and neurological motor function score was decreased significantly in C group(P<0.05). Compared with C group, the expression of miR-122a was decreased, the expression of occludin was increased, the permeability of blood-spinal cord barrier was decreased, and neurological motor function score was increased significantly in M group(P<0.05).Conclusion miR-122a can regulate the expression of occludin and change the permeability of blood-spinal cord barrier.

ischemia-reperfusion injury；spinal cord；blood-spinal cord barrier；miR-122a；tight junction protein；occludin

2016-12-19,

2017-01-25

遼寧省博士科研啟動基金項目( No 20141035)； 國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81401000)

方 波(1979-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：圍術(shù)期中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)，通訊作者，Tel:024-83283100,E-mail：drunk0630@126.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.044.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.022

A

1001-1978(2017)05-0703-04

R-332；R322.81；R341；R342.4；R619.9