劉順翠，陳振毅，黃小庭，廖瑞哲

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科，福建 廈門 361000)

丙泊酚對(duì)新生大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

劉順翠，陳振毅，黃小庭，廖瑞哲

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院麻醉手術(shù)科，福建 廈門 361000)

目的 研究丙泊酚對(duì)新生大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法 原代分離和培養(yǎng)AST細(xì)胞，用GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。不同濃度丙泊酚(0、10、30、90 μmol·L-1)作用AST細(xì)胞8 h。MMT法檢測(cè)細(xì)胞生存率；Annexin V/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western blot 法測(cè)定線粒體cyt-C漏出；分光光度計(jì)法檢測(cè)caspase-3和caspase-9活性。結(jié)果 分離培養(yǎng)出原代AST，不同濃度丙泊酚(0、10、30、90 μmol·L-1)濃度依賴性地降低AST細(xì)胞生存率,誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體cyt-C漏出，上調(diào)促凋亡蛋白 caspase-3 和caspase-9,誘發(fā)AST凋亡。結(jié)論 丙泊酚在體外能誘發(fā)新生大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與丙泊酚誘導(dǎo)線粒體cyt-C釋放，激活線粒體凋亡通路有關(guān)。

丙泊酚；新生大鼠；大腦；星型膠質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞色素C

隨著靜脈麻醉技術(shù)的完善和相關(guān)基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，靜脈麻醉藥丙泊酚(propofol)由于具有快速起效、蘇醒迅速、持續(xù)輸注后無蓄積等優(yōu)點(diǎn)，在嬰幼兒麻醉和鎮(zhèn)靜中廣泛應(yīng)用[1]。丙泊酚通過與GABAA受體及鈣離子通道結(jié)合，延長(zhǎng)抑制性突觸后電位，干擾突觸間的信號(hào)傳遞，而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和麻醉作用[2]。研究表明，丙泊酚在臨床麻醉濃度內(nèi)可導(dǎo)致發(fā)育期大腦神經(jīng)毒性[3]，相關(guān)機(jī)制不明?，F(xiàn)有研究報(bào)道主要集中在丙泊酚對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的直接作用[4-5]，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)其他細(xì)胞的影響研究較少。本研究擬通過觀察丙泊酚對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes ,AST)的影響，進(jìn)而分析其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用機(jī)制。通過觀察不同劑量的丙泊酚對(duì)新生大鼠腦皮層AST凋亡的影響，分析大鼠腦皮層AST線粒體細(xì)胞色素C(cytochrome C,cyt-C)漏出量，促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性，探討丙泊酚誘發(fā)AST凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新生1～3 d SD大鼠[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005]，丙泊酚注射液(10 g·L-1，阿斯利康), DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和0.25%胰酶(HyClone)，免疫組化試劑盒(福州邁新)，一抗GFAP(N-18)-R、cyt-C(Santa Cruz)，Annexin V/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、caspase-3和caspase-9檢測(cè)試劑盒(Thermo)。

1.2 AST的原代培養(yǎng)和免疫組化鑒定

1.2.1 AST原代培養(yǎng)和純化 參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]，將新生1～3 d的SD大鼠乳鼠，-20℃冰箱冷凍麻醉，取兩側(cè)大腦皮層組織，預(yù)冷的PBS液中漂洗4～5次，用眼科剪剪成糜狀，0.25%胰蛋白酶消化10～15 min，期間用吹管輕輕吹打，使其成為細(xì)胞懸液， 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，重新加入含有血清的培養(yǎng)基吹打后，靜置10 min，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，加入含血清的培養(yǎng)基吹打制成初細(xì)胞懸液，用100目、200目篩網(wǎng)過濾，接種到培養(yǎng)皿，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～60 min，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，吸出初細(xì)胞懸液，離心(800 r·min-1)5 min棄上清，加入含血清的培養(yǎng)基吹打制成次細(xì)胞懸液，將過濾液以培養(yǎng)基稀釋后接種于培養(yǎng)瓶中，接種密度約為1×104個(gè)/cm2，以后每隔2～3 d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)9～14 d，換液時(shí)稍加震蕩，并用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床上，以260 r·min-1的速度振搖6 h，去除混雜的神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的上清液，后傳代，重復(fù)差速貼壁培養(yǎng)純化細(xì)胞，取傳代培養(yǎng)第3次細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)ABC法鑒定AST 制備細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定， 0.5% Triton X-100破膜，3% H2O2孵育去除內(nèi)源性過氧化物酶，1 ∶10正常山羊血清封閉，滴加GFAP一抗(1 ∶100)，陰性對(duì)照片滴加PBS代替一抗， 4℃孵育過夜，滴加羊抗兔IgG二抗(1 ∶100)孵育，滴加SABC液(1 ∶100)，孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察拍照[7]。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 將培養(yǎng)的AST細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。用10%脂肪乳溶解丙泊酚，實(shí)驗(yàn)組用不同濃度的丙泊酚處理(10、30、90 μmol·L-1)，對(duì)照組用相同體積10%脂肪乳處理。

1.4 MTT法檢測(cè)AST細(xì)胞增殖 細(xì)胞接種于96孔板，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理 8 h，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。方法如下：每孔加MTT 50 μL(終濃度5 g·L-1)，37℃孵育4 h；小心棄去MTT，每孔加DMSO 150 μL，震蕩，充分溶解；用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處讀取各樣本OD值。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率/% =(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%，計(jì)算細(xì)胞存活率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Annexin V/PI雙染檢測(cè)AST細(xì)胞凋亡 細(xì)胞接種于6孔板，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞(胰酶消化時(shí)間不易過長(zhǎng)，否則容易引起假陽性)，PBS洗滌細(xì)胞2次，加500 μL的Binding buffer懸浮細(xì)胞,加5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻,室溫避光反應(yīng)5～15 min,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用流式分析軟件FlowJo 7.6分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測(cè)AST線粒體cyt-C漏出情況 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細(xì)胞，按試劑盒方法分別提取AST細(xì)胞線粒體蛋白和線粒體外蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。等量線粒體內(nèi)外蛋白樣品分別行電泳，轉(zhuǎn)膜，抗cyto-C抗體室溫孵育，TBST溶液洗滌后，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影定影，掃描后用圖像處理軟件Phoretix 1D分析目標(biāo)條帶的灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 分光光度法檢測(cè)AST caspase-3和caspase-9活性 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，待其貼壁后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理8 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次, 4℃ Lysis buffer(每50 μL加入0.5 μL DTT)，冰上裂解30 min,離心取上清, 用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度。等量對(duì)照組和處理組細(xì)胞裂解液與caspase-3或caspase-9底物37℃孵育4 h。催化產(chǎn)生的黃色產(chǎn)物用于定量caspase活性。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于405 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度(A405)值。Caspase相對(duì)活性/%=(處理組A405值/對(duì)照組A405值)×100%[8]。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 AST細(xì)胞鑒定 骨架蛋白GFAP為成熟AST的特異性標(biāo)記物。GFAP免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，陽性產(chǎn)物呈棕黃色，主要分布于胞質(zhì)中，胞核未著色。隨機(jī)選擇6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)95%以上，證實(shí)獲得的為AST，且純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(Fig 1)。

Fig 1 GFAP stained astrocytes identified by immunohistochemistry A:×100; B:×200

2.2 丙泊酚處理降低AST細(xì)胞生存率 運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞生存率。如Fig 2所示，10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細(xì)胞生存率呈劑量依賴性地降低，與對(duì)照組比較，30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細(xì)胞生存率明顯下降(P<0.01)。

##P<0.01vscontrol

2.3 丙泊酚誘導(dǎo)AST細(xì)胞凋亡 Annexin V/PI雙染檢測(cè)AST細(xì)胞凋亡。如Fig 3所示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率僅為(3.90±0.61)%;10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細(xì)胞凋亡率逐漸升高，分別為(5.11±0.87)%、(6.53±1.18)%(P<0.05)、(9.74±1.51)%(P<0.01)。

2.4 丙泊酚誘導(dǎo)AST線粒體cyt-C釋放 蛋白免疫印跡結(jié)果如Fig 4所示，同對(duì)照組比較10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細(xì)胞線粒體cyt-C外漏逐漸增加。30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組cyt-C外漏明顯增加(P<0.05)。

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

2.5 丙泊酚誘導(dǎo)促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性增加 分光光度法檢測(cè)AST caspase-3和caspase- 9活性，結(jié)果如Fig 5所示，同對(duì)照組比較，10、30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組細(xì)胞，促凋亡蛋白caspase-3和caspase-9活性逐漸增加。30、90 μmol·L-1丙泊酚處理組caspase-3和caspase-9活性明顯增加(P<0.05)。

3 討論

丙泊酚在嬰幼兒麻醉和鎮(zhèn)靜中廣泛應(yīng)用，然而大腦在發(fā)育期對(duì)全麻藥誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的敏感性明顯增加[5]，但其相關(guān)作用機(jī)制不明。丙泊酚通過與GABAA受體及鈣離子通道結(jié)合，延長(zhǎng)抑制性突觸后電位，干擾突觸間的信號(hào)傳遞，而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜和麻醉作用，但研究認(rèn)為GABAA受體激活與丙泊酚誘發(fā)的發(fā)育期大腦神經(jīng)毒性無關(guān)[2]。臨床研究表明，嬰幼兒多次經(jīng)歷全麻可導(dǎo)致學(xué)習(xí)能力缺陷的風(fēng)險(xiǎn)增加[9]；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，丙泊酚在臨床相關(guān)濃度內(nèi)可損害其空間學(xué)習(xí)記憶能力[10]，可能與丙泊酚誘發(fā)發(fā)育期大腦廣泛神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)毒性有關(guān)[11]，但是其具體機(jī)制是什么？對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)還有怎樣的影響? 目前的研究多集中在丙泊酚對(duì)神經(jīng)元的直接作用方面，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中其他細(xì)胞的影響研究不多。

Fig 4 Effects of propofol on cytochrome C

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

Fig 5 Effects of propofol on activity of caspase-3

#P<0.05，##P<0.01vscontrol

在CNS中，膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過神經(jīng)元，占細(xì)胞總數(shù)的90%以上。近年來研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞在CNS中不僅僅起支持、營(yíng)養(yǎng)、修復(fù)和吞噬等作用，膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)和小膠質(zhì)細(xì)胞，并非完全的輔助細(xì)胞，它們參與了神經(jīng)元在腦內(nèi)活動(dòng)，在引導(dǎo)突觸發(fā)生、促進(jìn)突觸生長(zhǎng)、誘導(dǎo)突觸凋亡、調(diào)節(jié)突觸傳遞和維持突觸的正常功能等方面具有重要作用[12-13]。特別是發(fā)育期大腦膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育起關(guān)鍵作用，但是在靜脈麻醉藥丙泊酚誘發(fā)的發(fā)育期大腦損傷中，丙泊酚對(duì)AST會(huì)產(chǎn)生什么樣的影響，現(xiàn)有研究還不明確。

本研究選用出生1～3 d的新生SD大鼠，此時(shí)SD大鼠大腦皮層處于發(fā)育期，AST比例較大。實(shí)驗(yàn)過程中，通過將培養(yǎng)瓶置于37℃恒溫?fù)u床上，以260 r·min-1的速度振搖6 h，去除混雜的神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，后用反復(fù)差數(shù)貼壁培養(yǎng)的方法純化去除混雜的成纖維細(xì)胞及其他細(xì)胞，以得到純度較高的發(fā)育期AST后，用不同濃度丙泊酚(10、30、90 μmol·L-1)處理細(xì)胞8 h，發(fā)現(xiàn)丙泊酚在臨床維持全麻狀態(tài)的藥物濃度(30 μmol·L-1)可明顯抑制AST細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

腦正常發(fā)育過程中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生生理性凋亡以適應(yīng)腦功能和結(jié)構(gòu)的變化。相關(guān)資料顯示，內(nèi)源性細(xì)胞凋亡機(jī)制有：① 線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞在死亡誘導(dǎo)因子(如氧化應(yīng)激和鈣超載)作用下，線粒體細(xì)胞色素 C 漏出進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)， Apaf-1 與之結(jié)合活化，依次激活caspase-9與caspase-3，募集下游眾多的caspase，導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[14]；② 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：DNR損傷的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡,形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，活化caspase-12和caspase-3，募集下游眾多的caspase，導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[15]。 但本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚在臨床維持全麻狀態(tài)的藥物濃度(30 μmol·L-1)明顯增加AST線粒體cyt-C外漏， 增加caspase-9與caspase-3活性，提示丙泊酚可能通過誘導(dǎo)線粒體cyt-C外漏，誘發(fā)線粒體途徑的AST凋亡，而影響了腦正常發(fā)育過程。

總之,本研究結(jié)果表明體外臨床麻醉劑量的丙泊酚可誘導(dǎo)AST凋亡增加，機(jī)制可能與丙泊酚誘發(fā)發(fā)育期大腦神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體cyt-C外漏增加有關(guān)。

(致謝:感謝廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供的實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)支持!)

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Effect of propofol on apoptosis of cortical astrocytes isolated from neonatal rats

LIU Shun-cui, CHEN Zhen-yi, HUANG Xiao-ting, LIAO Rui-zhe
(DeptofAnesthesiologyandSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXiamenUniversity，XiamenFujian361000,China)

Aim To study the effects of propofol on apoptosis of cortical astrocytes isolated from neonatal rats.Methods Pure astrocytes (AST) were obtained from the cultured cerebral cortical cells and identified by the GFAP stain technology in neonatal rats. AST cells were treated with different concentrations of propofol(0,10, 30, 90 μmol·L-1) for 8 hours. Cell viability was measured by MTT method, and the apoptosis was detected by Annexin V/PI double staining. Cytochrome C (cyt-C) leakage was detected by Western blot. Caspase-3 and caspase-9 activities were measured by spectrophotometry.Results AST cells were administered with different concentrations of propofol(0,10,30, 90 μmol·L-1) for 8 hours. It decreased the survival rate in a concentration-dependent manner, induced the leakage of cyt-C in mitochondria, up-regulated the expression of pro-apoptotic protein caspase-3 and caspase-9, and induced AST apoptosis.Conclusion Propofol induces the apoptosis of astrocytes in neonatal rat cortexinvitro, which may be related to the activation of mitochondria apoptosis pathway induced by mitochondrial cyt-C release.

propofol; neonatal rats； brain; astrocytes; apoptosis; cytochrome C

2017-02-15,

2017-03-13

福建省教育廳中青年教師教育科研資助項(xiàng)目(No JA15861)；福建自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2017J01358)

劉順翠(1976-),女,副主任醫(yī)師,研究方向:麻醉藥理學(xué),E-mail: 514096301@qq.com; 廖瑞哲(1977-),女,副主任醫(yī)師,研究方向:麻醉藥理學(xué),通訊作者,E-mail: 531271662@qq.com

時(shí)間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.040.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.020

A

1001-1978(2017)05-0691-05

R-322；R322.81；R329.25；R971.2