張紅艷，翟 麗，王婷婷，李 珊，張艷輝，郭云良

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腦血管病研究所，山東 青島 266003)

胡黃連苷Ⅱ通過抑制cyto C/caspase-9 /caspase-3通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用

張紅艷，翟 麗，王婷婷，李 珊，張艷輝，郭云良

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腦血管病研究所，山東 青島 266003)

目的 研究胡黃連苷Ⅱ?qū)Υ笫竽X缺血/再灌注過程中cyto C/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。方法 環(huán)孢素(CsA)和蒼術(shù)苷(Atr)分別作為cyto C陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，改良Longa法制備缺血2 h再灌注24 h大鼠腦缺血/再灌注(I/R)模型。再灌注24 h后，TTC染色觀察腦梗死體積；免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)cyto C、caspase-9、caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 模型組大鼠腦缺血/再灌注后TTC顯示染色腦梗死體積明顯增加；免疫組織化學(xué)和Western blot顯示cyto C、caspase-9、caspase-3表達(dá)水平較假手術(shù)組明顯增多(P<0.05)。治療組大鼠TTC顯示腦梗死體積縮??；免疫組化和Western blot顯示cyto C、caspase-9、caspase-3表達(dá)水平與模型組相比明顯降低(P<0.05)。與Atr組相比，Atr+胡黃連苷Ⅱ組大鼠腦梗死體積縮小，免疫組化和Western blot顯示cyto C、caspase-9、caspase-3表達(dá)水平減弱(P<0.05)。結(jié)論 胡黃連苷II抑制缺血/再灌注損傷大腦神經(jīng)凋亡的機(jī)制可能與下調(diào)cyto C/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路蛋白有關(guān)。

胡黃連苷Ⅱ；腦；缺血/再灌注損傷；cyto C/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路；神經(jīng)保護(hù)；大鼠

缺血性腦卒中可導(dǎo)致腦損傷，是引起死亡和殘疾的主要原因[1]。急性腦缺血半暗帶損傷的機(jī)制很多，但這些分子機(jī)制之間的相互作用目前尚不十分清楚[2]。溶栓及時(shí)恢復(fù)血供是治療缺血性腦卒中的一種有效的治療方式。然而，溶栓再灌注療法通常會(huì)帶來細(xì)胞生化及代謝等問題，包括活性氧過量產(chǎn)生、鈣超載、線粒體損傷和細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致不可逆性的再灌注損傷[3]。而過量的活性氧作為細(xì)胞凋亡的一種刺激，可觸發(fā)線粒體凋亡途徑，致cyto C等凋亡因子的釋放[4]。一旦釋放入胞質(zhì)中，cyto C會(huì)激活下游caspase家族。其中，caspase-9是重要的啟動(dòng)器，參與cyto C依賴性的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而caspase-3則參與凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

《本草綱目》記載：胡黃連味苦性寒，具有“清熱燥濕”作用?！侗静萁?jīng)疏》曰：胡黃連“大寒至苦，極清之性，能清熱，一切濕熱、邪熱、陰分伏熱所生諸病，莫不消除”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，西藏胡黃連提取物含有胡黃連苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種環(huán)烯醚萜苷，其中胡黃連苷Ⅱ?yàn)橹饕行С煞?，含有鄰苯二酚基結(jié)構(gòu)，具有較好的抗氧化作用。本課題組前期研究探討胡黃連苷Ⅱ時(shí)間效應(yīng)窗[5]，在腦缺血半暗帶損傷中具有抗炎[6-7]、抗氧化[8]、抑制神經(jīng)凋亡的作用[9-10]，然而，其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制還有待研究。由于cyto C/caspase-9/caspase-3信號(hào)通路在神經(jīng)細(xì)胞的凋亡中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討胡黃連苷Ⅱ?qū)δX缺血/再灌注半暗帶損傷的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 缺血/再灌注模型制備 健康成年Wistar ♂大鼠120只，體質(zhì)量240～270 g，SPF級(jí)，青島市藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(魯)20100010]提供。大鼠術(shù)前禁食12 h，水合氯醛溶液(100 g·L-1)麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)。用牙科鉆定位(前囟左旁開5 mm、向后3 mm)鉆孔至硬腦膜，將激光多普勒血流檢測(cè)儀(PE-5001，Swedan)探頭經(jīng)孔固定在硬腦膜上，記錄左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的血流變化，應(yīng)用線栓法[11]制備缺血/再灌注(I/R)模型，缺血2 h時(shí)后，拔出線栓實(shí)現(xiàn)24 h再灌注。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：插入線栓后，局部腦血流量峰值降到插線前的30%及以下，拔出線栓后，rCBF恢復(fù)至插線前的80%及以上為模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功的96只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(Model)、治療組Ⅱ組(Treatment)、陽性對(duì)照藥組(Positive)、陽性對(duì)照藥+治療組(Positive+Treatment)、陰性對(duì)照藥組(Negative)、陰性對(duì)照藥+治療組(Negative+Treatment)、溶媒組(DMSO)，每組12只。

1.2 干預(yù)措施 假手術(shù)組線栓進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈10 mm后即刻退出。模型組建立模型，缺血2 h拔線栓后，腹腔注射生理鹽水0.5 mL。治療組將胡黃連苷Ⅱ(天津奎青有限公司)配制為10 g·L-1的溶液，在缺血2 h拔線栓時(shí)，腹腔注射胡黃連苷II溶液(20 mg·kg-1)。陽性對(duì)照藥組將環(huán)孢素A(CsA，Selleck公司)用DMSO配制成2 μmol·L-1的溶液，再灌注前15 min側(cè)腦室注射5 μL(腦立體定向儀，江灣Ⅰ型C，上海第二軍醫(yī)大學(xué)修配廠)。陽性對(duì)照藥+治療組與陽性對(duì)照藥組相同，CsA溶液注射結(jié)束后，給予胡黃連苷Ⅱ溶液。陰性對(duì)照藥組蒼術(shù)苷(Atr，上海同田生物技術(shù)有限公司)用生理鹽水配制成2 mmol·L-1的溶液，再灌注前15 min側(cè)腦室注射5 μL。陰性對(duì)照藥+治療組與陰性對(duì)照藥組相同，Atr溶液注射結(jié)束后，給予胡黃連苷Ⅱ溶液。溶媒組，再灌注前15 min側(cè)腦室注射DMSO溶液5 μL。1.3 腦梗死體積測(cè)量(TTC) 每組取4只動(dòng)物，腦缺血/再灌注24 h后，水合氯醛溶液(100 g·L-1)腹腔注射麻醉，斷頭取腦。生理鹽水將腦沖洗干凈，置于腦模具中。-20℃冷凍10 min后，自前向后連續(xù)冠狀切面切片(每片2 mm)，每個(gè)腦切5片，置于20 g·L-1的TTC磷酸鹽溶液中，37℃孵育10 min。數(shù)碼相機(jī)拍照，采用Adobe PhotoShop CS測(cè)量腦梗死體積。腦梗死體積(cerebral infract volume，CIV)=經(jīng)過視交叉平面的腦梗死面積/該層對(duì)側(cè)半球面積。

1.4 免疫組化 每組取4只動(dòng)物，于缺血2 h再灌注24 h后，水合氯醛溶液(100 g·L-1)麻醉后，心臟灌注生理鹽水和多聚甲醛溶液(40 g·L-1)各200 mL，取缺血部位腦組織。將組織置于多聚甲醛溶液(40 g·L-1)中固定2 h，蒸餾水浸泡4 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，每片厚5 μm，貼于載玻片上，常溫保存。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后，按二步法免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物公司)進(jìn)行染色。胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，陰性對(duì)照以PBS替代抗體，不出現(xiàn)陽性細(xì)胞。在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)不重疊視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)(PCI=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))，取其均值。

1.5 漿蛋白提取 每組取4只動(dòng)物，缺血2 h再灌注24 h后，水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注生理鹽水200 mL。每組取新鮮缺血腦組織100 mg，剩余凍存，用于總蛋白提取。根據(jù)線粒體/胞質(zhì)制備試劑盒(C3606，碧云天生物公司)提取漿蛋白。將100 mg新鮮缺血腦組織剪碎，放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)，按1 ∶10(重量 ∶體積)加入添加蛋白酶抑制劑的分離液A，600×g，4℃離心10 min。取上清，11 000×g，4℃離心15 min。將上清再次12 000×g，4℃離心15 min，取上清為漿蛋白。取少量BCA檢測(cè)蛋白濃度，剩余加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)混勻，置于97℃水浴8 min，冷卻后-20℃保存。

1.6 總蛋白提取和Western blot分析 取上述腦組織各100 mg，按組織與細(xì)胞裂解液10 mg ∶100 μL的比例加入細(xì)胞裂解液(碧云天生物公司)，置于冰上研磨。10 949×g，4℃離心15 min后取上清，BCA檢測(cè)蛋白濃度，剩余加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer(5×)混勻，置于97℃水浴8 min，冷卻后-20℃保存。各組均取樣品20 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至NC膜(66485，Pall Corporation，USA)，5% BSA室溫封閉2 h，加入cyto C(1 ∶5 000)、caspase-9(1 ∶2 000)、caspase-3(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶3 000)一抗，4℃過夜。HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1.5 h，凝膠成像分析系統(tǒng)(Biospectrum 810 Imaging system，UVP，USA)測(cè)定各條帶的灰度值。計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)灰度值(relative value of protein，RVP)。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積 方差分析顯示，不同處理組之間對(duì)I/R大鼠的腦梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.87，P<0.05)，I/R組、陰性對(duì)照藥組、溶媒組梗死體積明顯高于其他處理組。LSD兩兩比較顯示(Fig 1)：假手術(shù)組大鼠未見腦梗死；模型組大鼠可見明顯梗死灶，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.21，P<0.05)；治療組大鼠腦梗死體積明顯縮小，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.61，P<0.05)； 陰性對(duì)照藥組大鼠梗死灶明顯，陰性對(duì)照藥+治療組與陰性對(duì)照藥組相比，梗死體積明顯縮小(t=4.01，P<0.05)。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

2.2.1 cyto C表達(dá) 方差分析示不同組別之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.86，P<0.05)。LSD顯示(Fig 2)：假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)cyto C蛋白表達(dá)微弱，著色較淺。模型組大鼠胞質(zhì)cyto C蛋白表達(dá)明顯增多，陽性細(xì)胞數(shù)多于假手術(shù)組(t=9.80，P<0.05)。治療組大鼠胞質(zhì)cyto C蛋白表達(dá)明顯低于模型組(t=4.06，P<0.05)。陰性對(duì)照組大鼠陽性細(xì)胞較多，陰性對(duì)照+治療組與陰性對(duì)照組相比陽性細(xì)胞數(shù)減少，差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.90，P<0.05)。

Fig 1 Effect of picroside Ⅱ on the infarct area

A: TTC staining showed the effect of picroside Ⅱ on cerebral infarct area; B: The quantification results of TTC staining. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

2.2.2 caspase-9表達(dá) 方差分析可見不同處理組之間存在差異(F=15.55，P<0.05)。LSD兩兩比較顯示(Fig 3)：假手術(shù)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞caspase-9蛋白表達(dá)較弱，著色不明顯；模型組大腦皮層可見明顯棕黃色顆粒的caspase-9陽性細(xì)胞，數(shù)目較多，蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯增強(qiáng)(t=7.95，P<0.05)；治療組腦組織中caspase-9陽性細(xì)胞數(shù)量減少，表達(dá)減弱，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.08，P<0.05)；陰性對(duì)照組大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞大量神經(jīng)細(xì)胞固縮深染，空洞較多，可見明顯棕黃色顆粒的caspase-9陽性細(xì)胞；陰性對(duì)照+治療組陽性細(xì)胞數(shù)量下降，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.08，P<0.05)。

Fig 2 Effect of picroside Ⅱ on cyto C expression in I/R rats(×400)

A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on cyto C expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

Fig 3 Effect of picroside Ⅱ on caspase-9 expression in I/R rats (×400)

A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on caspase-9 expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

2.2.3 caspase-3表達(dá) 方差分析可見不同處理組之間存在差異(F=21.92，P<0.05)。LSD兩兩比較顯示(Fig 4)： 假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞見少量陽性caspase-3蛋白表達(dá)；模型組大鼠皮層可見明顯增多的caspase-3蛋白，表達(dá)量較多，明顯高于假手術(shù)組(t=9.83，P<0.05)；治療組陽性細(xì)胞表達(dá)量變?nèi)?，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.59，P<0.05)；陰性對(duì)照組蛋白表達(dá)量明顯升高，陰性對(duì)照+治療組與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.89，P<0.05)。

Fig 4 Effect of picroside Ⅱ on caspase-3 expression in I/R rats (×400)

A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on caspase-3 expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

2.3 Western blot分析

2.3.1 胞質(zhì)cyto C表達(dá) Cyto C蛋白表達(dá)采用胞質(zhì)細(xì)胞提取法。方差分析可見不同處理組之間存在差異(F=17.20，P<0.05)。LSD兩兩比較顯示(Fig 5)： 假手術(shù)組大鼠可見少量cyto C表達(dá)。模型組大鼠cyto C蛋白表達(dá)量明顯上升，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.53，P<0.05)。治療組cyto C表達(dá)量下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.39，P<0.05)。陰性對(duì)照組cyto C含量明顯增多；陰性對(duì)照+治療組cyto C表達(dá)量明顯下降，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.93，P<0.05)。

Fig 5 Cytosol cyto C expression in I/R rats by Western blot

A: Western blot assay of cytosol cyto C expression; B: Bar graph showed the relative amounts of cytosol cyto C normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

2.3.2 caspase-9表達(dá) 方差分析可見不同處理組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.34，P<0.05)。LSD兩兩比較顯示(Fig 6)：假手術(shù)組caspase-9蛋白表達(dá)量低；模型組大鼠caspase-9蛋白表達(dá)量較高，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.91，P<0.05)；治療組caspase-9表達(dá)量下降明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.11，P<0.05)；陰性對(duì)照+治療組caspase-9表達(dá)量明顯下降，與陰性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.40，P<0.05)。

Fig 6 Caspase-9 expression in I/R rats by Western blot

A: Western blot assay of caspase-9 expression; B: Bar graph showed the relative amounts of caspase-9 normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

2.3.3 caspase-3表達(dá) 方差分析可見不同處理組之間存在差異(F=16.34，P<0.05)。LSD 兩兩比較顯示(Fig 7)：假手術(shù)組大鼠caspase-3表達(dá)量較少。 模型組蛋白表達(dá)上升，與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.18，P<0.05)。治療組表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.14，P<0.05)。陰性對(duì)照+治療組蛋白表達(dá)量明顯降低，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.81，P<0.05)。

3 討論

腦缺血/再灌注時(shí)，cyto C從線粒體釋放入胞質(zhì)引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)是啟動(dòng)凋亡程序的關(guān)鍵。cyto C一旦釋放入胞質(zhì)，即可與Apaf-1和pro-caspase-9結(jié)合形成凋亡體，激活caspase-3,這對(duì)于缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡極其重要。Xing等[12]的研究表明，對(duì)于MCAO模型，缺血后處理會(huì)降低線粒體cyto C釋放入胞質(zhì)和caspase-3的活性，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。崔耀梅等[13]研究表明，在腦缺血/再灌注中，cyto C的釋放及其下游因子的激活與MPTP的開放有關(guān)。于麗等[14]研究表明，抑制NADPH氧化酶，減少ROS的產(chǎn)生，對(duì)腦缺血/再灌注損傷起保護(hù)作用。以上研究說明，減少ROS及抑制MPTP的開放及cyto C的釋放，對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。

Fig 7 Caspase-3 expression in I/R rats by Western blot

A: Western blot assay of caspase-3 expression; B: Bar graph showed the relative amounts of caspase-3 normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsAtr group

由于caspases可自我活化并能相互激活，因此凋亡過程一旦激活，即呈級(jí)聯(lián)放大作用。許多研究著力于caspases家族，以抑制caspases級(jí)聯(lián)式反應(yīng)作為開發(fā)治療腦缺血藥物的重點(diǎn)[15-16]。Caspase-9是線粒體凋亡途徑中的一個(gè)必須始動(dòng)子，而caspase-3是調(diào)節(jié)凋亡的關(guān)鍵蛋白。然而，僅通過抑制caspases來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞是暫時(shí)的，因?yàn)榫€粒體通透性一旦不可逆增加，細(xì)胞凋亡將不依賴于caspases繼續(xù)發(fā)生。cyto C的釋放從側(cè)面反映出線粒體通透性程度，胞質(zhì)中cyto C的減少，會(huì)對(duì)凋亡體產(chǎn)生影響，從而使caspase-3激活受到影響，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

環(huán)孢素A可特異性抑制cyto C的釋放，故選為陽性對(duì)照藥。蒼術(shù)苷為cyto C的選擇性激動(dòng)劑，故選為陰性對(duì)照藥。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在大鼠腦缺血/再灌注模型中，環(huán)孢素A可明顯抑制cyto C的表達(dá)，而蒼術(shù)苷對(duì)cyto C的表達(dá)則未見明顯作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，腦缺血/再灌注中，胡黃連苷Ⅱ能明顯減小腦梗死體積，由此推測(cè)其對(duì)腦缺血半暗帶有一定的保護(hù)作用。胡黃連苷Ⅱ?qū)yto C的抑制作用明顯，與環(huán)孢素A相比未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這從側(cè)面反映胡黃連苷Ⅱ?qū)τ诘蛲鲶w形成的抑制作用，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。胡黃連苷Ⅱ可下調(diào)caspase-9和caspase-3的表達(dá)水平，這可能與其抑制上游cyto C有關(guān)。環(huán)孢素A作為cyto C的特異性抑制劑，與胡黃連苷Ⅱ聯(lián)合應(yīng)用未見協(xié)同作用，其原因可能與胡黃連苷Ⅱ受體競爭性更強(qiáng)和胡黃連苷Ⅱ的藥物濃度適中有關(guān)。蒼術(shù)苷是cyto C的激動(dòng)劑，與環(huán)孢素A和胡黃連苷Ⅱ的保護(hù)作用相反。本文CsA與Atr的結(jié)果與Sun等[17]結(jié)果相一致。

本研究尚存在不足之處，例如Atr組與模型組相比，腦梗死體積等不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CsA組與胡黃連苷Ⅱ+CsA組比較，其梗死體積等無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述情況可能與以下因素有關(guān)：① 造模過程中，再灌注時(shí)間較長，不需要加激動(dòng)劑通路已完全激活；② 受體飽和性，胡黃連苷II與受體結(jié)合強(qiáng)，當(dāng)聯(lián)合用藥時(shí)未發(fā)揮協(xié)同作用，尚需進(jìn)一步研究。

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Picroside Ⅱ plays a neuroprotective effect by inhibiting cyto C/caspase-9/caspase-3 signal pathway following ischemia/reperfusion injury in rats

ZHANG Hong-yan, ZHAI Li, WANG Ting-ting, LI Shan, ZHANG Yan-hui, GUO Yun-liang
(InstituteofCerebrovascularDiseases,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,QingdaoShandong266003,China)

Aim To investigate the neuroprotective effect of picroside Ⅱ(PIC) on cyto C/caspase-9/caspase-3 signal pathway following ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats.Methods Atractyloside(Atr) was selected as negative control, cyclosporin A(CsA) was selected as positive control, and PIC was selected as the treatment medicine. The I/R model was made by inserting a monofilament suture into internal carotid artery for 2 h, and then reperfused for 24 h. The cerebral infarction volume was detected by TTC staining, and the expression of cyto C, caspase-9 and caspase-3 were determined by immunohistochemical assay and Western blot.Results In model group, the cerebral infarct volume was obviously large; the expression of cyto C, caspase-9 and caspase-3 was increased significantly more than that in sham group(P<0.05). In PIC group, the cerebral infarct volume was significantly improved; the expression of cyto C, caspase-9 and caspase-3 was significantly decreased than that in model group(P<0.05). In Atr+PIC group, the rat infarction volume was reduced, and the expression of cyto C, caspase-9 and caspase-3 was significantly decreased than that in Atr group(P<0.05).Conclusion The mechanism of PIC inhibiting neuron apoptosis in focal cerebral I/R rats might be through down-regulating the expression of cyto C, caspase-9 and caspase-3.

picroside Ⅱ; cerebrum; ischemic/reperfusion injury; cyto C/caspase-9/caspase-3 signal pathway; neuroprotection; rats

2017-02-16,

2017-03-15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81274116)

張紅艷(1989-)，女，碩士生，研究方向：腦血管病，E-mail：1042022747@qq.com； 郭云良(1961-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腦血管病，通訊作者，E-mail：guoqdsd@163.com

時(shí)間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.032.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.016

A

1001-1978(2017)05-0668-07

R-332；R284.1；R322.81；R329.25；R743.310.22；R977.6