劉 超,孫如玉,黃 健,劉麗華,方圣云,3

(安徽醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院、2.臨床藥理研究所,安徽 合肥 230032；3.美國馬里蘭大學生物醫(yī)學工程技術中心,馬里蘭巴爾的摩 21201)

DPF2基因RNA干擾對人胰腺癌細胞PANC-1增殖、凋亡和細胞周期的作用研究

劉 超1,孫如玉1,黃 健1,劉麗華2,方圣云1,3

(安徽醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院、2.臨床藥理研究所,安徽 合肥 230032；3.美國馬里蘭大學生物醫(yī)學工程技術中心,馬里蘭巴爾的摩 21201)

目的 已知DPF2參與白血病以及腫瘤的發(fā)生，但是DPF2是否參與胰腺癌發(fā)生和進展還不清楚，因此觀察了DPF2基因RNA干擾對胰腺癌細胞系PANC-1細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響。方法 采用慢病毒介導的DPF2基因RNA干擾敲低PANC-1細胞的DPF2表達，通過克隆形成實驗和MTT實驗檢測DPF2基因RNA干擾對PANC-1細胞增殖的作用，通過流式細胞術檢測DPF2 基因RNA干擾對PANC-1細胞凋亡和細胞周期的作用。結果 慢病毒介導的DPF2基因RNA干擾中劑量和高劑量(2 μL和4 μL)使PANC-1細胞的DPF2表達明顯降低。與陰性對照組比較，DPF2基因RNA干擾明顯抑制PANC-1細胞活力和克隆形成，還促進PANC-1的凋亡。此外，DPF2基因RNA干擾引起細胞周期的S期阻滯，明顯減少G2/M周期的細胞數(shù)量。結論 DPF2可能參與胰腺癌細胞PANC-1的增殖、凋亡過程和細胞周期的調(diào)控，通過慢病毒介導的DPF2基因RNA干擾敲低DPF2蛋白表達，可能為尋找潛在的抗胰腺癌的新方法提供實驗依據(jù)。

DPF2；RNA干擾；慢病毒；PANC-1；增殖；凋亡；細胞周期

胰腺癌是極具侵襲性的惡性腫瘤，發(fā)病率不斷上升[1]。至2030年，胰腺癌將成為第2位的腫瘤致死因素[2]。胰腺癌對放療和化療耐受，進展快速又無明顯臨床癥狀[3]，導致早期診斷治療極為困難，預后差[4]。胰腺癌患者的5年生存率約5%[5]，盡管外科手術提供了治療的機會，但是多數(shù)病人由于難以根除，失去治愈時機的同時，還存在較高的復發(fā)機率[5]。

DPF2是SWI/SNF復合物的亞單位之一，為白細胞擴增和自我更新所需，也是白血病相關的致病蛋白[6]。此外，DPF2作為SWI/SNF復合物和RelB/p52之間的調(diào)節(jié)蛋白，在非經(jīng)典的NF-κB信號通路的轉錄激活和相關的腫瘤發(fā)生中起重要作用[7]。因此，我們推測DPF2也可能參與其他實體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但是DPF2對胰腺癌的作用目前還不清楚。近年來研究表明[8]，發(fā)現(xiàn)致瘤相關基因可以成為腫瘤治療的重要靶點。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)方法高效特異地沉默致瘤基因，是腫瘤治療的方法之一[9]。此外，特異性沉默致瘤基因還可協(xié)同相關化學藥物療法，增強抗癌藥物療效[10]。因此，本實驗中我們采用帶有DPF2-RNAi的慢病毒感染胰腺癌細胞系—PANC-1細胞，觀察DPF2基因RNA干擾對PANC-1細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，希望能較好地明確DPF2基因是否參與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展，為探索治療胰腺癌新方法提供新的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株 PANC-1細胞，購自中國科學院細胞庫(上海)。

1.2 藥物與試劑 胎牛血清(Ausbian，批號：VS500T)。DMEM(Corning，批號：10-013-CVR)。胰酶(上海生工生物工程股份有限公司，批號：T0458-50G)。Puromycin(Clontech，批號：631305)。慢病毒：LV-DPF2 siRNA #25540和對照NC siRNA病毒(Genechem，上海)，慢病毒信息和序列見參考文獻[11]?？贵w：兔抗DPF2抗體(Proteintech，美國)，兔抗GAPDH抗體(Proteintech，美國)。MTT(Genview，批號：JT343)。DMSO(上海試一化學試劑，批號：130701)。Giemsa染色液(上海鼎國生物技術有限公司，批號：AR-0752)。凋亡試劑盒(eBioscience，批號：88-8007)。碘化丙啶(propidium，PI)(Sigma，批號：P4170)。RNase A(Fermentas，批號：EN0531)。

1.3 儀器 熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71)。CO2培養(yǎng)箱(日本三洋，SANYO MCO-175)。離心機(賽默飛世爾科技中國有限公司，F(xiàn)resco 21)。生物安全柜(上海振樣創(chuàng)空氣凈化設備有限公司，Bio 1200-Ⅱ-A2)。酶標儀(Tecan infinite，M2009PR)。流式細胞儀(Millipore Guava easyCyte HT)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) PANC-1細胞培養(yǎng)參考文獻方法[11]。細胞用Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM)培養(yǎng)基(添加體積分數(shù)0.10的胎牛血清、50 kU·L-1青霉素和50 mg·L-1鏈霉素雙抗)，置于體積分數(shù)0.05二氧化碳條件下培養(yǎng)。細胞覆蓋率近90%時，用0.25%胰酶消化制備細胞懸液，計數(shù)后，以1 ∶3的比例傳代，每3 d傳代1次。至對數(shù)生長期時，取細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 慢病毒感染 慢病毒介導的DPF2-RNAi干擾方法參考本課題組的報道[12]。細胞經(jīng)胰酶消化，用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，按每孔5×104個細胞接種到6孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，保證感染時鋪板量達到30%左右。感染時，每孔更換1 mL新鮮培養(yǎng)基,加入熒光標記的慢病毒(LV-DPF2 siRNA #25540病毒和對照病毒)1～4 μL進行感染。在感染后10 h更換為常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后72 h左右，熒光顯微鏡觀察GFP的表達情況，熒光率即為陽性感染率。當細胞陽性感染效率達到70%以上，進行相關后續(xù)實驗。

2.3 MTT檢測 參考文獻方法[13]，將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞消化后制備細胞懸液，并進行計數(shù)。于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔接種2×103個細胞，每組重復5孔，鋪5張96孔板。鋪板后連續(xù)培養(yǎng)5 d，最后1 d培養(yǎng)終止前4 h，于每孔中加入20 μL 5 g·L-1的MTT。4 h后吸去培養(yǎng)液，保留孔板底部的甲臜顆粒，再加100 μL DMSO，振蕩器振蕩2～5 min后，用酶標儀在490 nm 檢測OD值。最后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2.4 細胞克隆形成檢測 參考文獻[14]，將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞消化后制備細胞懸液，進行計數(shù)。于6孔培養(yǎng)板中每孔接種1×103個細胞，每組設3個復孔。將接種好的細胞繼續(xù)培養(yǎng)到14 d，每隔3 d換液1次。實驗終止前3 h，在熒光顯微鏡下對細胞克隆進行拍照。拍照結束后，用1×PBS洗滌細胞1次，每孔加入1 mL質量濃度為10 g·L-1多聚甲醛，固定細胞60 min，再用1×PBS洗滌細胞1次。然后，每孔加入潔凈且無雜質的Giemsa染液500 μL，保持10～20 min，其后用ddH2O洗滌細胞數(shù)次并晾干，用數(shù)碼顯微鏡拍照后，進行克隆計數(shù)。

2.5 凋亡檢測 參考文獻[4]和試劑盒方法，將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞制成細胞懸液，進行細胞計數(shù)。然后于6孔培養(yǎng)板中接種細胞，每組設3個復孔。待細胞覆蓋率約為70%時，經(jīng)胰酶消化細胞，用完全培養(yǎng)基重懸，收集于5 mL離心管中，在1 300 r·min-1離心5 min，棄上清，用4 ℃預冷的D-Hanks(pH=7.2～7.4)緩沖液洗滌細胞沉淀。后用1×binding buffer洗滌細胞沉淀1次，1 300 r·min-1離心3 min，收集細胞。再用200 μL 1×binding buffer重懸細胞沉淀，并加入10 μL Annexin V染色，室溫避光10～15 min。最后補加400～800 μL 1×binding buffer，上機檢測。

2.6 細胞周期檢測[15]采用PI-流式細胞術方法，病毒感染后d 3,將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞制成細胞懸液，進行計數(shù)。然后于6 孔板培養(yǎng)板中接種細胞，待細胞覆蓋率約為80%時，經(jīng)胰酶消化，用完全培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，收集細胞于5 mL離心管中，每組設3個復孔。將細胞置于1 300 r·min-1離心5 min，棄上清后，用4 ℃預冷的D-Hanks(pH=7.2～7.4)洗滌細胞1 次，重復1 300 r·min-1離心5 min，棄上清。然后用4 ℃預冷的體積分數(shù)為0.75乙醇固定細胞1 h，經(jīng)1 300 r·min-1離心5 min 除去固定液，再用D-Hanks洗滌細胞1次。加入細胞染色液(0.6～1 mL)重懸細胞，上機時細胞通過率為300～800個·s-1。配制細胞染色液如下：40×PI母液(2 g·L-1) ∶100×RNase母液(10 g·L-1) ∶1×D-Hanks=25 ∶10 ∶1 000。

2.7 Western blot檢測 Western blot檢測參考文獻方法[16]。所用抗體如下：兔抗DPF2(1 ∶500, Proteintech，美國) 和兔抗GAPDH(1 ∶2 000，Proteintech, 美國)。

3 結果

3.1 DPF2基因RNA干擾明顯抑制PANC-1細胞DPF2蛋白表達 為了檢測DPF2在胰腺癌細胞PANC-1中的生物學作用，用可以表達綠色熒光蛋白的介導DPF2基因RNA干擾的慢病毒感染PANC-1細胞。感染后d 3，通過熒光顯微鏡檢測熒光表達，兩組慢病毒均顯示了較高的感染效率，見Fig 1A～1D。與陰性對照病毒(NC)組相比較，DPF2-RNAi干擾(KD)組明顯抑制了PANC-1細胞中DPF2的表達，而且中劑量和高劑量(2 μL和4 μL)組的效果優(yōu)于低劑量(1 μL)組，具有一定的劑量依賴性，見Fig 1E。

Fig 1 Effect of lentivirus-mediated DPF2-RNAi on expression of DPF2 in PANC-1 cells

A:Fluorescence photograph of negative control(NC)-RNAi lentivirus group；B:Phase photograph of the same area in A; C:Fluorescence photograph of DPF2-RNAi lentivirus group；D:Phase photograph of the same area in C; E:DPF2-RNAi downregulates expression of DPF2 in PANC-1 cells in a dose dependent style. The number of 1, 2 and 4 indicate the amount of lentiviruses used for infection(1,2 and 4 μL). NC: negative control; KD: knockdown of DPF2

3.2 DPF2基因RNA干擾抑制PANC-1細胞增殖 克隆形成是測定細胞增殖能力的有效方法之一，通過感染后細胞在細胞培養(yǎng)板上的克隆形成能力來提示慢病毒感染后細胞的成瘤能力。結果顯示，與陰性對照組比較，DPF2-RNAi明顯減少了PANC-1細胞的克隆形成，見Fig 2A、2B。通過MTT方法檢測細胞活力，同樣可以驗證細胞增殖能力。如Fig 2C、2D所示，與陰性對照組比較，DPF2-RNAi明顯降低了PANC-1細胞的存活能力。而且DPF2-RNAi的上述作用在細胞增殖的d 3呈現(xiàn)明顯效果(P<0.05)，并在d 4和d 5進一步增強(P<0.01)，見Tab 1。以上結果提示DPF2可能促進PANC-1細胞的增殖，而DPF2-RNAi則明顯抑制PANC-1細胞的增殖。

3.3 DPF2基因RNA干擾促進PANC-1細胞凋亡 通過流式細胞術檢測處于凋亡狀態(tài)的PANC-1細胞數(shù)量來檢驗目的基因與細胞凋亡的關聯(lián)。統(tǒng)計結果顯示，與陰性對照組比較，DPF2-RNAi明顯增加PANC-1細胞的凋亡率(P<0.01)，見Fig 3。提示DPF2對PANC-1細胞的凋亡起重要作用，而通過DPF2-RNAi則可以促進PANC-1細胞的凋亡。

Fig 2 Effect of DPF2-RNAi on colony formation and cell viability of PANC-1 cells

A:The colony numbers of the KD group were decreased significantly as compared to those of the NC group;B:The typical cell colonies of both the NC group and the KD group;C:The OD values of the PANC-1 cells investigated by MTT assay in the indicated groups following 1, 2, 3, 4 and 5 days of the infection;D:The change fold of the OD values of PANC-1cells in the indicated groups.*P<0.05,**P<0.01vsNC group

Fig 3 Effect of DPF2-RNAi on apoptosis of PANC-1cells

A:Percentage of the apoptotic PANC-1 cells in the total cells was increased significantly by the lentivirus-mediated DPF2-RNAi;B and C:The typical FACS analysis data of both the NC and KD groups are shown

GroupTime/d12345NC0．16±0．010．20±0．010．39±0．010．58±0．010．97±0．01KD0．16±0．0040．19±0．010．36±0．02?0．48±0．01??0．76±0．01??

*P<0.05,**P<0.01vsNC

3.4 DPF2基因RNA干擾引起PANC-1細胞周期的S期阻滯并減少G2/M期細胞數(shù)量 采用了PI -FACS的方法檢測DPF2對PANC-1細胞周期的作用，見Fig 4A～4C。結果表明：在G1期時，陰性對照組細胞數(shù)(32.10±1.27)%和DPF2-RNAi組(31.75±1.19)%無明顯差異。在S期時，與陰性對照組細胞數(shù)比較(49.28±1.11)%，DPF2-RNAi組PANC-1細胞數(shù)(53.41±0.96)%明顯增加(P<0.01)。而在G2/M期，與陰性對照組(18.62±0.33)%比較，DPF2-RNAi組細胞數(shù)(14.84±0.24)%明顯降低(P<0.01)。這些結果提示，DPF2-RNAi可以通過S期細胞阻滯和減少G2/M期細胞數(shù)量來影響PANC-1的細胞周期。

Fig 4 Effect of DPF2-RNAi on cell cycle of PANC-1 cells

A:DPF2-RNAi induced the S-phase arrest and decreased G2/M phase population significantly of the PANC-1 cells;B and C:The typical PI-FACS analysis data of both the NC and KD groups are shown.**P<0.01vsNC group

4 討論

胰腺癌是一種嚴重危害患者的常見胃腸道惡性腫瘤，給包括中國在內(nèi)的各國帶來嚴重負擔。近年來，針對胰腺癌的研究取得了快速進展，尋找新的生物或基因標記物既有助于揭示腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制，又可以為化學藥物治療腫瘤提供新的靶點[17]。

腫瘤的發(fā)生與腫瘤細胞惡性增殖有關[18]，抑制腫瘤細胞增殖是抗腫瘤的有效手段[19]。本研究表明，除了抑制PANC-1細胞克隆形成外，DPF2-RNAi還可以明顯抑制PANC-1細胞活力，并且有較好的時間-效應關系。一方面提示DPF2基因可能以調(diào)控細胞活力為特點，參與胰腺腫瘤細胞增殖，另一方面提示利用DPF2-RNAi抑制DPF2蛋白的表達是潛在抗胰腺腫瘤細胞增殖的手段。

促進腫瘤細胞凋亡可用于腫瘤的治療[20]。本研究發(fā)現(xiàn)DPF2-RNAi促進PANC-1細胞凋亡，提示DPF2-RNAi還可能通過促進胰腺腫瘤細胞凋亡，成為潛在抑制胰腺腫瘤細胞生長的方法。我們還發(fā)現(xiàn)，雖然DPF2-RNAi后PANC-1細胞凋亡有明顯增加，但是總凋亡比例較低。因此，采用致腫瘤細胞凋亡的化學藥物聯(lián)合DPF2-RNAi的方法來進一步研究基因干擾和化療藥物的協(xié)同抗腫瘤作用是我們下一步的研究方向之一。

細胞周期各階段調(diào)節(jié)障礙導致的細胞無限增殖主要與腫瘤的進展密切相關。本研究表明，DPF2-RNAi可以明顯使PANC-1細胞阻滯于S期，并且明顯減少G2/M期的PANC-1細胞數(shù)，提示DPF2對腫瘤細胞周期有重要調(diào)節(jié)作用。DPF2-RNAi對上述細胞周期的影響可能是其抑制胰腺腫瘤進一步進展的潛在機制。檢測細胞周期，特別是S期和G2/M期相關調(diào)控蛋白的表達也將是我們下一步的研究方向。

綜上所述，本研究結果提示DPF2可能參與胰腺腫瘤細胞PANC-1的增殖和凋亡過程，還可調(diào)控PANC-1的細胞周期，DPF2-RNAi干擾方法為我們尋找對抗胰腺腫瘤進展的新方法提供了實驗基礎。

[致謝：感謝安徽醫(yī)科大學省部級重點實驗室培育項目(No SBSYS-1404)和安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院分子細胞中心實驗室的支持。]

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Effect of DPF2-RNAi on proliferation, apoptosis and cell cycle of PANC-1 cells

LIU Chao1, SUN Ru-yu1, HUANG Jian1, LIU Li-hua2,FANG Sheng-yun1,3
[1.SchoolofBasicMedicalSciences,2.InstituteofClinicalPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 3.CenterforBiomedicalEngineeringandTechnology(BioMET),UniversityofMaryland,MDBaltimore21201,USA]

Aim DPF2 has been reported to be involved in pathogenesis of leukaemia and oncogenic activity.However, the role of DPF2 in oncogenesis and pathogenesis of pancreatic cancer remains unclear. Therefore, the present research aims to investigate the effects of DPF2-RNAi on proliferation, apoptosis and cell cycle regulation of a pancreatic cell line, PANC-1 cells.Methods The lentivirus-mediated DPF2-RNAi was employed to knockdown DPF2 expression in PANC-1 cells, and the role of DPF2-RNAi in proliferation, apoptosis and cell cycle regulation of the PANC-1 cells was examined through MTT assay, colony formation assay and flowcytometry assay.Results The lentivirus-mediated DPF2-RNAi middle and high doses(2 μL and 4 μL) significantly decreased the expression of DPF2 in the PANC-1 cells. DPF2-RNAi decreased cell viability and colony formation, and increased apoptosis of the PANC-1 cells. Besides, DPF2-RNAi inducedthe S-phase arrest and decreased G2/M phase population of the PANC-1 cells.Conclusions DPF2 may play a crucial role in proliferation, apoptosis and cell cycle regulation of PANC-1 cells. Knockdown of DPF2 through lentivirus-mediated DPF2-RNAi may provide experimental basis for finding a new method for therapy of pancreatic cancer.

DPF2; RNAi; lentivirus; PANC-1; proliferation; apoptosis; cell cycle

2017-02-07，

2017-02-24

國家自然科學基金資助項目(No 31271159)；安徽省高校學科拔尖人才學術資助重點項目(No gxbjZD2016030)

劉 超(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：干細胞和腫瘤發(fā)生，E-mail: chaol1974@ahmu.edu.cn

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.024.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.012

A

1001-1978(2017)05-0647-07

R329.24；R329.25；R329.28；R373.9；R735.902.2；R977.6