徐偉超,顧劍潔,葛 蓉,劉麗均,徐 平,芮 榮

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095； 2.中科院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031；3.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上海 201615)

研究報告

C57BL/6J小鼠凍融胚胎移植后所得小鼠及其子代生物學(xué)特性數(shù)據(jù)測定與分析

徐偉超1,2,顧劍潔3,葛 蓉3,劉麗均3,徐 平2,芮 榮1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095； 2.中科院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031；3.上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，上海 201615)

目的 探討C57BL/6J(B6)小鼠冷凍復(fù)蘇胚胎移植后所得小鼠及其子代的平均體增長和血液生化等部分生物學(xué)特性數(shù)據(jù)的變化。方法 實驗分為3組。實驗組I：凍融胚移植組， B6小鼠體外受精后的2-cell胚胎采用EFS法冷凍，復(fù)蘇后移植到受體(ICR小鼠)輸卵管內(nèi)所產(chǎn)的小鼠(雄鼠30只，雌鼠20只)；實驗組II：凍融胚胎移植所產(chǎn)的小鼠成熟后經(jīng)自然交配得到的子一代(雄鼠26只，雌鼠17只)；對照組：正常飼養(yǎng)和自然交配所得的子代(雌雄小鼠各20只)。3組小鼠飼養(yǎng)至16周齡，每周定時測定體質(zhì)量,至16周齡時采血，測定各組小鼠血清生化值，并進行分析比較。結(jié)果 實驗組I雌雄小鼠初生重和1 ～16周的平均體重均顯著高于對照組(P<0.01)，實驗組II雌鼠體重從12周開始均顯著高于對照組(P<0.01)，而雄鼠只有部分周齡與對照組有差異，其余周齡則差異無顯著性；實驗組I和實驗組II小鼠的血清生化值與對照組相比除AST、TP和Ca等項目無變化外，其余項目均發(fā)生了顯著或極顯著的上調(diào)或下調(diào)。結(jié)論 冷凍對胚胎移植所得小鼠及其自然繁殖子一代的平均體增長和血清生化值有一定影響。

凍融胚胎；體增長；血清生化指標(biāo)

胚胎冷凍保存的研究起始于上世紀(jì)40年代末，Polge 和Smith[1]用甘油作防凍劑，保存兔胚胎獲得成功。1972年Whittingham等[2]用慢速冷凍方法獲得小鼠胚胎的成功保存。1978年Willadsen[3]建立了玻璃化冷凍保存技術(shù)。此后，隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，胚胎冷凍技術(shù)日新月異，冷凍的物種范圍也不斷擴展。玻璃化冷凍是指是應(yīng)用高濃度的冷凍保護劑保護細胞，通過快速冷凍從而避免細胞內(nèi)冰晶形成的一種冷凍技術(shù)。與傳統(tǒng)的程序化冷凍相比，具有操作簡便、省時、冷凍損傷小等特點，因此成為胚胎冷凍保存技術(shù)的研究熱點[4,5]。然而，玻璃化凍存液濃度很高，在常溫下對胚胎具有一定的毒性，并且冷凍這一處理也會對胚胎產(chǎn)生一定的影響。現(xiàn)階段研究多集中在胚胎冷凍復(fù)蘇對配子和胚胎的發(fā)育潛能，以及胚胎表觀遺傳學(xué)方面的影響[6]。

本研究以C57BL/6J小鼠作為研究對象，對冷凍復(fù)蘇移植所得小鼠及其后代(子一代)的部分生物學(xué)特性與正常繁育的小鼠進行比較，旨在探討胚胎冷凍對冷凍所得個體及其子代的影響，現(xiàn)將初步結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6JSlac小鼠，受體小鼠為SPF級ICR小鼠，均由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供(SCXK(滬)2012—0002)。小鼠飼養(yǎng)于屏障式動物房內(nèi)(SYXK(滬)2012-0002)，溫度(20～24)℃，相對濕度40%～60%，以60Co輻照滅菌(30 kGy)的配合飼料(滬飼證<2014>04001)飼養(yǎng)，自由采食和飲水，12 h明/12 h暗自動光控。

1.2 實驗分組

實驗分為3組，實驗組I：凍融胚移植組，B6小鼠體外受精后的2-cell胚胎，采用EFS法冷凍，復(fù)蘇后移植到受體(ICR小鼠)輸卵管內(nèi)所得到的小鼠(雄鼠30只，雌鼠20只)；實驗組II：凍融胚胎移植所得的小鼠成熟后經(jīng)自然交配得到的子一代(雄鼠26只，雌鼠17只)；對照組：正常飼養(yǎng)和自然交配所得的子代(雌雄小鼠各20只)。

1.3 實驗試劑與儀器

1.4 實驗方法

近年來，一種名叫“糧食銀行”的新型糧食流通業(yè)態(tài)在各地涌現(xiàn)，即企業(yè)代農(nóng)戶存儲糧食，農(nóng)民可按約定提取商品或折現(xiàn)?！凹Z食銀行”不僅破解了農(nóng)民儲糧賣糧難題，還減輕了運營主體資金和原糧供應(yīng)壓力。

2.1 體重比較

試劑：PMSG(寧波第二激素廠，批號110915)；hCG(寧波第二激素廠，批號120711)；EFS20：含20%乙二醇的FS(Ficoll PM-sucrose)液；EFS40：含40%乙二醇的FS液；0.75 mol/L蔗糖；0.25 mol/L蔗糖；HTF：參照Quinn P (1985)[7]配制；KSOM：參照Lawitts (1993)[8]和Erbach (1994)[9]配制，所用試劑均購自Sigma公司;血液生化試劑盒(南京建成生物工程研究所，20151026)。儀器：實體顯微鏡(Nikon，SMZ645); CO2培養(yǎng)箱(Hera, cell, Kandro);日立7080全自動血液生化分析儀；手術(shù)器械；移液槍(Gilson)；液氮罐等。

3.上市公司數(shù)量不斷增加。截至2017 年底，深圳境內(nèi)上市公司達273家，同比增長17.17%，排名全國第三，其中中小板112家、創(chuàng)業(yè)板82家，合計194家，連續(xù)11年位居大中城市首位；境內(nèi)上市公司總市值5.34 萬億元，首次超過上海，躍居全國第二；而自2014年新三板擴容以來，新三板掛牌企業(yè)增長量迅猛，從無到平均每年超過200家，增長量位居全國首位，截至2017年10月底，全市就有新三板掛牌公司830家。

針對郁閉度低，且部分區(qū)域出現(xiàn)面積較大的空地的林區(qū)，在進行森林撫育管理工作時，應(yīng)當(dāng)加大人工投入，伐除空地區(qū)域的雜草和雜樹，并在春、秋兩季進行主要樹木的補栽，填補林中空地。補種之后，管理人員還應(yīng)當(dāng)做好相應(yīng)的幼林撫育工作，定期修枝，及時施加水、肥，幫助幼木成長。

在柔性直流輸電系統(tǒng)的發(fā)展過程中，不同的換流站之間連接的輸電線路較多。通常情況下，線路之間的直流潮流會按照換流站之間的電壓以及線路電阻進行自動分配，在該自動分配狀態(tài)下，部分指定線路會受到一定的影響而不能實現(xiàn)完全經(jīng)受換流站進行獨立控制，當(dāng)直流潮流分配的自由度被控制后，會造成后續(xù)一系列線路潮流在進行電力運輸時無法正常推進調(diào)度工作，最終影響廣州市供電公司電網(wǎng)的正常運行[1]。為了保證電網(wǎng)能夠正常輸電，通常會采用串聯(lián)的形式將附加的線路直流潮流控制器引入電網(wǎng)中，借以實現(xiàn)靈活有效的控制治理電網(wǎng)線路潮流。

1.4.1 超排與體外受精：下午3:00對3～4周齡C57BL/6J雌鼠腹腔注射PMSG每只10 IU，48 h后腹腔注射hCG，每只10 IU，次日早上采集卵團和雄鼠精子，待精子于HTF液滴內(nèi)獲能1～1.5 h后吸取適量獲能精液于卵團內(nèi)，次日早上可看到2-cell胚胎，洗胚并冷凍。

1.4.2 胚胎冷凍、復(fù)蘇和移植： 胚胎冷凍復(fù)蘇采用本實驗室王俊風(fēng)等[10]的EFS二步玻璃化冷凍法與相應(yīng)的復(fù)蘇法。移植采用輸卵管移植法，即將復(fù)蘇后的胚胎移植至假孕1d的ICR母鼠輸卵管內(nèi)，兩側(cè)輸卵管各移植15～20枚胚胎。

4.2 多途徑提高現(xiàn)有基層中醫(yī)師素質(zhì) 多途徑、多手段提高基層中醫(yī)師素質(zhì)。一是開展針對性強的繼續(xù)教育項目，提高基層中醫(yī)師知識和技能水平，繼續(xù)教育項目除了中西醫(yī)基本技能的培訓(xùn)，還應(yīng)側(cè)重中醫(yī)前沿知識、社會醫(yī)學(xué)和心理學(xué)、傳統(tǒng)文史哲學(xué)的培訓(xùn)。二是各級衛(wèi)生部門應(yīng)積極鼓勵中專及以下學(xué)歷的基層中醫(yī)師提升學(xué)歷，通過成人?？苹虮究平逃?，提高學(xué)歷的同時促進職稱的提升，可以全額報銷或報銷一定比例的學(xué)費，并保障學(xué)習(xí)期間的待遇。三是各級衛(wèi)生部門應(yīng)積極組織中醫(yī)師承或確有專長的基層中醫(yī)師，通過集中培訓(xùn)和學(xué)習(xí)，提高其獲得助理執(zhí)業(yè)醫(yī)師或鄉(xiāng)村助理全科醫(yī)師資格證書，規(guī)范行醫(yī)。

1.4.3 小鼠體重測定： 分別稱量實驗組和對照組小鼠初生重(1 d)，以及1～16周每周的體重，比較實驗組與對照組小鼠各時間點體重平均值并繪制生長曲線圖。

由圖1和圖2可以看出，凍融胚移植所得小鼠(實驗組I)的體重自出生起到16周齡都極顯著的大于對照組小鼠的體重(P<0.01)。而其后代(實驗組II)小鼠則有所不同，其中雄鼠除12～14周齡外，其他周齡均與對照組無顯著差異，雌鼠則有所不同了，9周齡與11周齡時體重顯著高于對照組(P<0.05)，12～16周齡的體重極顯著的高于對照組(P<0.01)。

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)方法： 采用IBM SPSS Statistics 20軟件對數(shù)據(jù)進行處理，進行t檢驗，P值<0.05表示差異顯著，P值<0.01表示差異極顯著，否則差異不顯著。

圖1 實驗組與對照組雌鼠體重比較Fig.1 Comparison of the body weight of female mice between experimental and control groups.

注：與對照組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01.圖2 實驗組與對照組雄鼠體重比較Note. Compared with the control group, *P<0.05，** P<0.01.Fig.2 Comparison of the body weight of male mice between experimental and control groups

2 結(jié)果

3)如圖6c所示情況，機體軸線與設(shè)計軸線平行，存在偏移量，此時需調(diào)節(jié)支撐油缸，使掘進機向設(shè)計軸線靠攏，轉(zhuǎn)變?yōu)閳D6b狀態(tài)。

1.4.4 血清生化值測定： 實驗組和對照組小鼠飼養(yǎng)至16 周齡，采集血清后測定其血清生化值，測定項目包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、總蛋白TP、白蛋白ALB、堿性磷酸酶ALP、血糖Glu、尿素氮BUN、肌酐CREA、血鈣Ca、血磷P、總膽固醇CHOl、甘油三酯TG、高密度脂蛋白HDL和低密度脂蛋白LDL這14項，然后實驗組與對照組小鼠作比較。

2.2 血清生化比較

由表1可以看出，實驗組I小鼠除AST、TP、Ca和TG這些項目與對照組無顯著差異外，其余項目均發(fā)生了顯著或極顯著的上調(diào)或下調(diào)。實驗組II小鼠僅AST、TP和Ca與對照組無顯著差異，其余項目與對照組相比較發(fā)生了顯著或者極顯著的上調(diào)或下調(diào)。但是除上述整體觀的差異外，各實驗組雌雄小鼠的表現(xiàn)又有所不同，實驗組I的雌鼠ALT、BUN和CREA，實驗組I雄鼠Glu，實驗組II雌鼠LDL-C這些項目與對照組相比差異也無顯著性。

3 討論

冷凍過程本身可能會引起重要的細胞內(nèi)改變，如改變轉(zhuǎn)錄因子活性，減少胚胎發(fā)育潛能，增加不完整的DNA片段，改變某些基因的表達活性等等[11-13]。這些變化會對子代小鼠生理特性和遺傳特性產(chǎn)生影響，周經(jīng)委[14]等的發(fā)現(xiàn)凍胚移植小鼠的體重從出生到12周齡都是高于正常繁育小鼠的，而且凍胚移植小鼠組的脂肪和肌肉含量也是顯著高于對照組的。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)凍胚移植小鼠印記基因H19/Igf2的表達與正常組差異有顯著性，并發(fā)現(xiàn)這是由于該印記基因的調(diào)控區(qū)域發(fā)生變化的結(jié)果。也有研究發(fā)現(xiàn)冷凍胚胎不會對子代產(chǎn)生影響，如梁琳琳等[16]研究玻璃化冷凍胚胎移植對小鼠子代發(fā)育和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍對子代小鼠生長發(fā)育和記憶功能無明顯影響。劉先菊等[17]通過利用生化標(biāo)記和微衛(wèi)星檢測法觀察近交系C57BL/6J小鼠胚胎冷凍后的遺傳質(zhì)量是否發(fā)生改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍(EFS40，straw)C57BL/6J小鼠胚胎移植后所得小鼠的遺傳物質(zhì)并未造成影響，其遺傳特性保持穩(wěn)定。

本實驗生長曲線的結(jié)果顯示實驗組I小鼠體重從出生至16周齡均極顯著的高于對照組，該結(jié)果與周經(jīng)委[14]的研究結(jié)果相同，造成初生重較大的原因可能是由于凍胚復(fù)蘇移植后胎兒數(shù)目較少的緣故，但是斷奶以后小鼠體增長仍然居高不下則可能是由于胚胎體外培養(yǎng)與冷凍處理所致。當(dāng)實驗組I小鼠自由交配產(chǎn)生實驗組II小鼠以后，卻發(fā)現(xiàn)除了實驗組II雌鼠從11周開始生長速度又快起來以外，其余雌雄小鼠多數(shù)周齡的體重與對照組無顯著差異，故認為實驗組I小鼠自由交配的后代部分糾正了生長過快這一問題，但是雌鼠11周以后體增長仍然快于對照組這一問題值得深入分析。血液生化比較結(jié)果顯示實驗組I和實驗組II小鼠與對照組相比除AST、TP和Ca等少數(shù)項目沒有差異以外，而其余項目都發(fā)生了顯著或極顯著的上調(diào)或下調(diào)， AST在臨床上是肝功能檢查的指標(biāo)，TP反映了肝臟的合成功能，Ca受腎上腺、腎臟和甲狀旁腺等多種器官的調(diào)節(jié)，這3項沒有差異表明相關(guān)器官組織調(diào)節(jié)功能正常。我們知道血液生化值是有一個正常范圍的，在這個范圍之內(nèi)我們都可以認為該值是正常的，那么血液生化值的差異數(shù)據(jù)是否代表與該數(shù)據(jù)相關(guān)的組織器官功能的異常，比如影響ALP值的肝臟功能和與影響CREA值的腎臟功能，這需要我們進一步的研究驗證。

我們知道，生物體的生長發(fā)育涉及許多基因相互作用，胚胎時期基因的微小變化可能對子代產(chǎn)生深遠的影響， Mamo等[18]用高密度的基因芯片技術(shù)研究了玻璃化冷凍過程對小鼠8細胞胚胎內(nèi)基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)其中有628個基因的表達發(fā)生改變，這些基因主要調(diào)節(jié)新陳代謝和應(yīng)激反應(yīng)。這些研究表明了胚胎冷凍技術(shù)對胚胎的基因?qū)用娴挠绊?。我們在實驗中也對凍胚后代做了芯片分析并篩選出了大量差異表達基因，后面如何將這種差異性與具體的生理特性變化聯(lián)系起來需要進一步研究探討。

本研究選取了體增長和血液生化值這些指標(biāo)來探討凍胚后代生理特性的變化，其代表性是有限的，后面還需要在組織層面和分子層面來研究凍胚后代的變化，從而對凍胚后代有更深入的認識。

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Mensurement and analysis of biological characteristics of C57BL/6J mice and their offsprings after frozen-thawed embryo transfer of C57BL/6J mice

XU Wei-chao1,2, GU Jian-jie3, GE Rong3, LIU Li-jun3, XU Ping2, RUI Rong1

(1. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agriculture University, Nanjing 210095, China; 2. Shanghai Institutes for Biological Sciences, SIBS, Shanghai 200031; 3. Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd, Shanghai 201615)

Objective To investigate the changes of average body weight gain and serum biochemical indexes of C57BL/6J mice (B6 mouse) and their offspings after frozen-thawed embryo transfer of B6 mice. Methods The mice were divided into three groups in this study. In the experimental group I (E-I, 30 males and 20 females), 2-cell embryos after in-vitro fertilization were collected, and cryopreserved by EFS method, then obtained the offsprings after transplantation of the recovered embryos to oviduct of recipient mice (ICR mouse). In the experimental group II (E-II, 26 males and 17 females), when the mice from E-I grew to maturity, the offsprings were obtained from natural mating of mice from E-I. In the control group (20 males and 20 females), the offsprings came from conventional feeding and natural mating. The three groups of mice were raised to 16 weeks old, weighing the body weight at a regular time intervals, and the serum biochemical indexes were obtained from 16-week-old mice. Then the changes of average body weight and serum biochemical indexes of the mice were analyzed. Results The average body weight of E-I mice was significantly higher than that of control group at each week-age (P<0.01). The average body weight of E-II female mice was significantly higher than that of the control group in 12-16-week old mice (P<0.01), but the average body weight of E-II male mice showed no significant differences compared with the control group except for few weeks. The serum biochemical indexes of E-I and E-II mice were changed in all items except for AST, TP and Ca. Conclusions There are some effects on the average body weight gain and serum biochemical indexes of C57BL/6J mice and their offspings after frozen-thawed embryo transfer.

Frozen-thawed embryo; Body weight gain; Serum biochemical index; C57BL/6J mice

上海市科委科研計劃項目(15140900100,14140900500)。

徐偉超(1991-)，男，碩士生，研究方向：動物生殖工程和低溫生物學(xué)，E-mail：932716206@qq.com。

徐平(1964-)，男，研究員，研究方向：實驗動物低溫生物學(xué)和實驗動物遺傳性疾病模型，Email：pingxu@sibs.ac.cn;芮榮(1962-)，男，教授，研究方向：動物生殖調(diào)控與產(chǎn)科疾病，Email：rrui@njau.edu.cn。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0069-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.012

2016-11-09