周 康， 殷 音， 彭 毅， 楊 徐

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科，石河子，新疆 832000)

研究報告

二脒那秦在肺動脈高壓模型大鼠中的預防和治療作用

周 康， 殷 音， 彭 毅， 楊 徐

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心內科，石河子，新疆 832000)

目的 探究二脒那秦(DIZE)對肺動脈高壓(PAH)模型大鼠的預防及治療作用。方法 采用左肺葉切除聯(lián)合野百合堿(MCT)腹壁皮下注射建立PAH大鼠模型，100只成年雄性Wistar大鼠隨機分成空白對照組(A組)、DIZE對照組(B組)、PAH模型組(C組)、DIZE處理PAH模型組(D組)和(DIZE+C-16)處理PAH模型組(E組)，利用活性熒光共振能量轉移(FRET)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定血管緊張素轉化酶2(ACE2)、血清IL-6及IL-8水平，并測定平均肺動脈壓(mPAP)、右心室肥厚指數(shù)(RVHI)，計算中膜厚度與肺動脈外徑的比例(WT)、內膜增生評分，并通過彈力纖維染色分析肺血管病變。結果 RVHI、ACE2酶活性、WT及內膜增生評分比較：與A組比較，C組、D組和E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；D組和E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。五個組在各個指標整體分析中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同時減輕肺動脈中膜肥厚，并抑制肺小動脈內膜增生。該研究結論為二脒那秦治療人類PAH提供實驗基礎。

二脒那秦；野百合堿；肺動脈高壓；大鼠

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一組由異源性疾病和不同發(fā)病機制引起的以肺血管阻力持續(xù)增高為特征的臨床病理生理綜合征。其主要特征為肺動脈阻塞引起肺血管阻力及肺動脈壓力漸進性升高，伴隨不可逆的肺血管重構，最終導致右心衰竭而死亡[1]。目前雖發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、前列腺素類、內皮素受體拮抗劑、特定種類干細胞等具有舒張血管功能藥物及細胞，可以緩解或治療高血壓病[2-5]，但對高發(fā)病率、高死亡率的PAH卻效果較差，急需尋找一種新的藥物來提高療效。二脒那秦是以對硝基苯甲酸、對甲苯磺酰胺為原料經復雜化學反應合成的化學試劑，曾一直用來治療大型家畜的焦蟲和錐蟲??；血管緊張素轉化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)通過形成舒血管物質可以對血壓、心臟、腎臟、呼吸及其他系統(tǒng)進行調解，是心血管功能重要的調節(jié)器[6]。有研究指出兩者之間存在關系，即二脒那秦作為ACE2的激活劑，在改善高血壓方面具有重要的作用[7]。為探討二脒那秦對ACE2的作用及對高血壓預防及治療效果，本研究利用二脒那秦在肺動脈模型大鼠中進行實驗研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

動物：健康成年雄性Wistar 大鼠100只，體質量(190～210)g，平均(198.6±2.6)g，由石河子大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號： SCXK(新)2011-0001；動物使用許可證號： SYXK(新)2011-0003；新疆省醫(yī)學實驗動物中心倫理委員會批準文號：20141022-015。

試劑：MCT由Sigma公司生產；二脒那秦購自濟南偉都化工有限公司；Trizol試劑由Vitrogen Life公司生產；ACE2抑制劑(C-16)購自Cayman Chemical；Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH和賴諾普利由美國RD System公司生產；IL-6和IL-8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由石河子大學實驗動物中心提供；其余試劑為分析純。

1.2 顯微鏡和攝像系統(tǒng)及圖片分析測量軟件信息

光學顯微鏡及攝像系統(tǒng)來自日本Nikon公司，型號HB-10101AF；Medlab-E生物信號系統(tǒng)設備來自南京美易科技有限公司；生物機能實驗系統(tǒng)來自成都泰盟科技有限公司，型號BL-420E；Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)來自美國Media Cybemeties公司。

1.3 動物分組及模型建立

分組：將100只Wistar大鼠隨機分為5組，每組20只：空白對照組(A組)、DIZE對照組(B組)、PAH模型組(C組)、DIZE處理PAH模型組(D組)和(DIZE+C-16)處理PAH模型組(E組)。除A組B組外，均按下法建立PAH模型。

各組實驗：正常對照組對Wistar大鼠腹壁皮下注射等量生理鹽水，并給予生理鹽水灌胃5 mL/d；DIZE對照組對Wistar 大鼠腹壁皮下注射等量生理鹽水，并給予二脒那秦灌胃0.25 mg/kg·d；PAH模型組對PAH大鼠給予生理鹽水灌胃5 mL/d；DIZE處理PAH模型組對PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d；(DIZE+C-16)處理PAH模型組對PAH大鼠予以二脒那秦灌胃0.5 mg/kg·d，C-16溶于生理鹽水，濃度為20 μg/mL，加入容積為200 μL的微滲透泵，植入背部皮下，以0.25 mL/h(100 μg/d)的速度持續(xù)皮下注射。所有各組均連續(xù)28 d到達實驗終點。

1.4 血流動力學指標和右心肥厚指數(shù)測定

參照劉杰等[9]方法，將10 cm 長硬膜外導管末端1～1.5 cm 加熱拉伸，并使其彎曲成魚鉤狀，用注射器注水成功表示肺動脈導管通暢。到達實驗終點后將大鼠取出，12%烏拉坦(劑量為 8 mL/kg)對大鼠行腹腔注射，麻醉后將大鼠固定于手術臺上，術中持續(xù)面罩給氧。分離大鼠右側頸外靜脈，將充滿肝素鹽水的右心導管后插入，一端連接換能器另一端與監(jiān)護儀相連，當置入導管進入右心室穩(wěn)定后記錄其右室收縮壓 (RVSP)，監(jiān)護儀出現(xiàn)肺動脈波形時，待其穩(wěn)定后記錄平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP)。高鉀注射處死大鼠，剪開胸腔取出心肺，用20 mL注射器收集大鼠全血并分離右室(RV)和左室加室間隔(LV+S)鹽水洗凈，濾紙抽干后稱重，將(RV)/(LV+S)作為右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。

1.5 血清IL-6、IL-8水平檢測

將到達實驗終點處死后收集到的大鼠全血4℃下靜置60 min，收集血清。按照ELISA法參照試劑盒說明利用酶標儀檢測血清中IL-6、IL-8水平。

1.6 肺組織ACE2酶活性檢測

參照譚宇等[10]采用活性熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法檢測ACE2酶活性。利用ACE2可以水解熒光肽底物Mca-Ala-Pro-Lys(Dnp)-OH產生兩個熒光發(fā)色基團，在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉移(即發(fā)生能量共振轉移)的原理，將到達實驗終點處死后收集到的大鼠肺組織勻漿，按照1∶10比例稀釋，50 μg/L濃度加入賴諾普利阻斷ACE2的作用，45 μL勻漿液與10 μmol熒光底物充分混合后，采用激光誘導熒光檢測器(美國TriSep-2100型)，以310 nm(激發(fā)波長)和420 nm(發(fā)射波長)進行檢測。

1.7 肺組織病理學觀察

收集獲得的肺組織用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片Verhoeff-鐵蘇木素染色，參照吳思婧等[11]人的操作步驟，利用Image-proplus 6.0圖像分析系統(tǒng)觀察肺動脈的病變情況。沒有內膜增生記0分、內膜增生<50%記1分，>50%記2分；100～200 μm肺動脈以中膜肥厚為主要的病理改變，計算中膜厚度與肺動脈外徑的比例 (wall thickness, WT%)。分析比較增生程度的差異。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 二脒那秦對肺組織ACE2酶活性的影響

肺組織ACE2酶活性比較結果：經單因素方差分析，5個組整體分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要數(shù)據(jù)來看：與A組比，B組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組、E組顯著降低(P<0.05)，D組顯著升高(P<0.05)；與D組、E組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.2 二脒那秦對mPAP和RVHI的影響

血液動力學和RVHI比較結果：方差分析顯示，5個組整體分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合數(shù)據(jù)來看：與A組比，B組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組、D組和E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與D組比，E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2。

2.3 二脒那秦對中膜肥厚和內膜增生的影響

5個組整體分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較：與A組WT及內膜增生評分比，B組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組、D組和E組增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與D組比，E組評分明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表3。

顯微鏡下染色切片結果顯示C組、E組大鼠肺小動脈外側彈力纖維間距明顯增寬，管壁厚度增加，表現(xiàn)為中膜肥厚；C組、E組大鼠肺小動脈內彈力纖維被破壞，內層管壁厚度增加，內膜增生分數(shù)值增加；D組內膜增生分數(shù)值較C組、E組下降，見圖1。

2.4 二脒那秦對血清中IL-6、IL-8水平的影響

血清中IL-6、IL-8水平比較結果：5個組整體分析差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩兩比較并結合主要數(shù)據(jù)來看：與A組比較，B組、D組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組、E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與D組比，E組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表4。

表1 二脒那秦對肺組織ACE2酶活性的影響

注：RFU表示相對熒光單位。與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. RFU represents the relative fluorescence units. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05

表2 二脒那秦對mPAP和RVHI的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with group A,*P<0.05; compared with group D,#P<0.05.

表3 二脒那秦對WT及內膜增生評分的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

表4 二脒那秦對血清中IL-6、IL-8水平的影響

注：與A組比較，*P<0.05；與D組比較，#P<0.05

Note. Compared with the group A,*P<0.05; compared with the group D,#P<0.05.

注：PAH大鼠100～200 μm直徑肺動脈主要表現(xiàn)為中膜肥厚，50～100 μm直徑肺動脈主要表現(xiàn)為內膜增生；C組表現(xiàn)為中膜肥厚和內膜增生；D組二脒那秦灌注后中膜肥厚和內膜增生明顯減輕；E組C-16注射后，表現(xiàn)和C組類似。圖1 不同組別大鼠動脈中膜肥厚及內膜增生情況(標尺=100 μm)Note. The pulmonary arteries in diameter of 100-200 μm showed mainly media hypertrophy. The pulmonary arteries in diameter of 50-100 μm showed mainly intimal hyperplasia in the PAH rats. The group C showed media thickening and intimal hyperplasia, and the medial thickening and intimal hyperplasia were significantly alleviated in the group D after perfusion of diminazene. After injected with C-16, the performance of group E was similar to that of group C.Fig.1 The thickening of arterial media and intima hyperplasia of rats in different groups (Bar=100 μm).

3 討論

肺動脈高壓是由心、肺或肺血管本身疾病等多種原因引起的一種病理生理狀態(tài)，臨床表現(xiàn)為肺動脈壓異常升高。最新血流動力學診斷標準為：在海平面、靜息狀態(tài)下，右心導管測量平均動脈壓≥25 mmHg[12,13]。野百合堿誘導大鼠PAH制備PAH動物模型已成為研究的常用方法。其主要原理可能是MCT自身并無生物活性，經吸收入血后，在肝臟代謝成為含五元雜環(huán)的吡咯野百合堿具有生物活性，吡咯野百合堿隨血流經過肺時損傷肺血管內皮細胞，使血管屏障功能受損。血液中彈性蛋白酶、凝血酶等蛋自酶外滲，觸發(fā)單核細胞等炎癥細胞在受累動脈周圍浸潤，繼發(fā)平滑肌細胞增生等肺血管重構件改變[14]。

本研究為探討二脒那秦對PAH的作用機制，利用MCT制備大鼠PAH模型，選擇0.25 mg/kg·d的二脒那秦用量，探討對PAH大鼠模型的作用機制。研究結果顯示，C組、D組和E組在肺組織ACE2酶活性方面有不同，D組加入二脒那秦與C組比較ACE2酶活性提高，而加入C-16(一種ACE2抑制劑)后ACE2酶活性降低，表明二脒那秦在一定程度上可提高ACE2的活性。此外，與D組比較，E組在肺組織ACE2酶活性、血液動力學、RVHI、WT、內膜增生評分方面有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)，表明ACE2表達量的增加可以降低mPAP、RVHI和WT，同時減輕肺動脈中膜肥厚，并抑制肺小動脈內膜增生。ACE2是一種鋅依賴性金屬蛋白酶。它可降解 Ang II羧基端的苯丙氨酸，生成 Ang-(1-7)，同時也可降解 Ang I 的羧基末端，轉化成 Ang-(1-9)。Ang-(1-7)、Ang-(1-9)參與血管張力的調節(jié)，還通過抑制平滑肌細胞增殖和遷移，降低肺動脈壓力。ACE2是心血管方面重要的調節(jié)器，在人體心臟、腎臟、肺臟、睪丸、胃腸、血管平滑肌細胞、血管內皮細胞、子宮內膜、胰腺和卵巢等處均有表達[15]。有研究結果表明PAH模型中ACE2 酶活性水平的降低與肺血管平滑肌細胞過度增生和遷移增加有關[16]。當肺過度表達ACE2或使用ACE2激活劑激活ACE2過表達時，不僅能抑制血管壁增厚，還能減弱血管肌化程度，從而改善PAH中的肺血管重構。龔晶婧等[17]將重組ACE2的慢病毒與平滑肌細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ACE2能通過下調AT1受體的表達，通過抑制STAT3磷酸化從而抑制平滑肌細胞增生。以上研究均表明ACE2在調節(jié)PAH方面的重要作用。

本研究結果顯示:與A組血清中IL-6、IL-8水平比較，B組、D組無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；C組、E組差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與D組血清中IL-6、IL-8水平比較，E組差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。研究結果表明使用二脒那秦后，PAH大鼠模型IL-6、IL-8炎性細胞因子的表達量下降。多數(shù)研究結果證實PAH的發(fā)生涉及細胞、體液介質和分子遺傳等多個方面[18]。PAH觸發(fā)單核細胞等炎癥細胞在受累動脈周圍浸潤，繼發(fā)平滑肌細胞增生等肺血管重構件改變。而缺氧、自身免疫性抗體、病原微生物等多種因素可以導致促炎癥因子表達升高，激活炎癥細胞和下游的信號傳導通路啟動增殖過程和炎性病變。研究發(fā)現(xiàn)PAH患者叢樣肺血管病灶中有巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，炎癥在PAH發(fā)病中起重要作用[19]，但PAH中IL-8標志物水平變化未見報道。大鼠炎性細胞因子的分泌降低，炎癥細胞和下游的信號傳導通路啟動增殖過程和炎性病變受到抑制，對治療PAH大鼠肺血管方面意義重大。本研究結論與相關報道結論類似，表明IL-6、IL-8炎性細胞因子表達水平的下降與PAH治療有重要關系[20]。

綜上所述，使用二脒那秦可以提高ACE2酶活性，并有效降低mPAP、RVHI和WT，同時減輕肺動脈中膜肥厚，并抑制肺小動脈內膜增生。本研究為化學藥物治療人類PAH提供了一種思路。

[1] 徐健, 左祥榮, 解衛(wèi)平, 等. 內質網應激與肺動脈高壓 [J]. 江蘇醫(yī)藥, 2015, 41(1): 74-77.

[2] 張曉慧. 阿托伐他汀聯(lián)合黃芪治療慢性阻塞性肺疾病并肺動脈高壓的效果 [J]. 寧夏醫(yī)科大學學報, 2015, 37(12): 1459-1461.

[3] 宋燕峰, 曹潔. 堿性成纖維細胞生長因子轉染骨髓間充質干細胞移植治療肺動脈高壓 [J].中國組織工程研究, 2015, 19(6): 918-922.

[4] 金玉潔,肖桂芝,王文倩,等. 新型內皮素受體拮抗劑馬西替坦 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2013, 28(3): 405-408.

[5] 王楊, 劉慧, 田野, 等. 鈣通道阻滯劑與心腦血管病 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2012, 12(30): 5971-5973.

[6] Lopes PR, Moreira MC, Marques SM, et al. Association of exercise training and angiotensin-converting enzyme 2 activator improves baroreflex sensitivity of spontaneously hypertensive rats [J]. Braz J Med Biol Res, 2016, 49(9): e5349.

[7] Ferreira AJ, Moraes PL, Foureaux G, et al. The angiotensin-(1-7)/Mas receptor axis is expressed in sinoatrial node cells of rats [J]. J Histochem Cytochem, 2011, 59(8): 761-768.

[8] 倪樂. 脂肪間充質干細胞對野百合堿誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠IL6、TNF-α、BNP的影響 [D]. 福建醫(yī)科大學, 2014.

[9] 劉杰, 劉川川, 劉輝琦, 等. 低壓低氧對SD大鼠肺動脈壓及肺組織骨橋蛋白表達的影響 [J].中國動脈硬化雜志, 2016, 24(1): 29-33.

[10] 譚宇, 楊淑均, 惠汝太, 等. 血管緊張素II通過活性氧調控ACE和ACE2的表達 [J]. 中國分子心臟病學雜志, 2015, 15(2): 1288-1291.

[11] 吳思婧, 郭雯, 陳夢娜, 等. 血管緊張素1-7預防肺動脈高壓右心衰竭發(fā)展的實驗研究 [J].心肺血管病雜志, 2015, 34(8): 652-656, 667.

[12] 李媛(綜述), 王安才(審校). ACE2-Ang(1-7)-Mas軸與肺動脈高壓的研究進展 [J]. 疑難病雜志, 2015, 14(2): 210-213.

[13] 馬倍, 陳建英. 血管緊張素轉化酶2在肺動脈高壓發(fā)病機制中的研究進展 [J]. 廣東醫(yī)學, 2016, 37(2): 297-299.

[14] Voelkel NF, Tamosiuniene R, Nicolls MR. Challenges and opportunities in treating inflammation associated with pulmonary hypertension [J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2016, 14(8): 939-951.

[15] Dai HL, Guo Y, Guang XF, et al. The changes of serum angiotensin-converting enzyme 2 in patients with pulmonary arterial hypertension due to congenital heart disease [J]. Cardiology, 2013, 124(4): 208-212.

[16] Liu D, Chen Y, Zhang P, et al. Association between circulating levels of ACE2-Ang-(1-7)-MAS axis and ACE2 gene polymorphisms in hypertensive patients [J]. Medicine (Baltimore), 2016, 95(24): e3876. [17] 龔晶婧, 盧卓強,曹金龍, 等. 血管緊張素轉換酶2基因轉染抑制大鼠平滑肌細胞血管緊張素II1型受體表達及下游轉錄激活子3信號通路 [J]. 中華心血管病雜志, 2012, 40(7): 607-613.

[18] de Man FS, Tu L, Handoko ML, et al. Dysregulated renin-angiotensin-aldosterone system contributes to pulmonary arterial hypertension [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2012, 186(8): 780-789.

[19] Steppan J, Tran HT, Bead VR, et al. Arginase inhibition reverses endothelial dysfunction, pulmonary hypertension, and vascular stiffness in transgenic sickle cell mice [J]. Anesth Analg, 2016, 123(3): 652-658.

[20] 徐磊, 付秀華, 王立紅, 等. 丹參酮IIA減輕野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型IL-6和IL-8的表達 [J]. 華南國防醫(yī)學雜志, 2015, 29(7): 503-506.

Preventive and therapeutic effect of diminazene in the rat model of pulmonary arterial hypertension

ZHOU Kang, YIN Yin, PENG Yi, YANG Xu

(Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi, Xinjiang 832000, China)

Objective To explore the preventive and therapeutic effects of diminazene (DIZE) on pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats. Methods Left pulmonary lobectomy combined with injection of monocrotaline was used to establish a rat model of pulmonary arterial hypertension. One hundred adult male Wistar rats were randomly divided into blank control group (group A, n=20), DIZE control group (group B, n=20), PAH model group (group C, n=20), PAH model plus DIZE group (group D, n=20) and PAH model plus DIZE and C-16 group (group E, n=20). Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), IL-6 and IL-8 levels were determined by fluorescence resonance energy transfer (FRET) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), and the mean pulmonary arterial pressure (mPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) were measured. The wall thickness (WT) and intimal hyperplasia score were calculated, and the pulmonary vascular lesions were analyzed using elastic fiber staining. Results RVHI, ACE2 enzyme activity and WT in the group A were significantly different from those of the groups C, D and E (P<0.05). Those of the group D and E were significantly different (P<0.05). The five groups showed significant differences in the overall analysis of each index (P<0.05). Conclusions Diminazene can increase the ACE2 enzyme activity, and decrease the mPAP, RVHI and WT, while reducing the pulmonary arterial medial hypertrophy, and inhibit intimal hyperplasia of pulmonary arterioles. The results of this study provide an experimental basis for the use of diminazene in the treatment of human pulmonary hypertension.

Diminazene; Monocrotaline; Pulmonary hypertension; Rat

周康(1969-)，男，副主任醫(yī)師、副教授，從事心血管內科方面的研究。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0034-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.006

2016-11-14