周沛飛，胡 東，張 巖，劉 昊，田發(fā)明，邢 磊

(1.寧波市象山縣西周中心衛(wèi)生院, 浙江 寧波 315722；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院, 河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心, 河北 唐山 063000)

研究報(bào)告

辛伐他汀對尾懸吊再負(fù)重大鼠長骨骨量恢復(fù)的影響

周沛飛1，胡 東1，張 巖2，劉 昊2，田發(fā)明3，邢 磊2

(1.寧波市象山縣西周中心衛(wèi)生院, 浙江 寧波 315722；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院, 河北 唐山 063000；3.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心, 河北 唐山 063000)

目的 觀察尾懸吊大鼠再負(fù)重骨量的變化及辛伐他汀干預(yù)對該過程的影響及機(jī)制。方法 5月齡大鼠24只分為4組，每組6只：正常對照組(CL組)、尾懸吊6周組(UL組)、尾懸吊3周再負(fù)重3周組(UL+RL組)、尾懸吊3周再負(fù)重加辛伐他汀干預(yù)3周組(10 mg/kg/d，UL+RL+SIM組)；實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周，處死大鼠取左側(cè)股骨進(jìn)行骨密度分析，取左側(cè)脛骨行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析；取右側(cè)股骨經(jīng)生物力學(xué)試驗(yàn)分析最大載荷和彈性模量；取右側(cè)脛骨制備組織勻漿，提取RNA和蛋白，分別采用real-time PCR和western blot檢測I型膠原(Col I)的表達(dá)。結(jié)果 (1)骨密度：CL組顯著高于其余3組(P< 0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著高于UL組(P<0.05);(2)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)：BV/TV：CL組顯著高于其余3組(P<0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著高于UL組(P<0.05)；Tb.N：CL組顯著高于其余三組(P<0.05)；Tb.Th：CL組顯著高于UL組(P<0.05)；Tb.Sp：CL組顯著低于其余三組(P<0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著低于UL組(P<0.05)。(3)生物力學(xué)檢測結(jié)果：CL組最大載荷、彈性模量顯著高于其他3組(P<0.05)。(4)Realtime PCR檢測結(jié)果：各組間ColⅠ的mRNA表達(dá)水平無顯著差別。(5)Western blot： UL組ColⅠIOD 值顯著低于CL組(P<0.05)，其余組間差異無顯著性。 結(jié)論 大鼠尾懸吊誘發(fā)下肢骨量丟失、微結(jié)構(gòu)退變、力學(xué)性能下降、I型膠原含量減少，而再負(fù)重后上述指標(biāo)可得到部分恢復(fù)，辛伐他汀干預(yù)不能促進(jìn)這一過程。

辛伐他??；尾懸吊；骨密度；骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)；生物力學(xué)；I型膠原

一定的應(yīng)力刺激可以促進(jìn)骨的生長，而應(yīng)力缺失則會導(dǎo)致骨形成能力下降、骨量減少，而誘因包括長期臥床、制動和失重等[1, 2]。研究表明每在太空飛行1個(gè)月可導(dǎo)致骨密度下降約1.5%，與絕經(jīng)后女性1年丟失骨量相當(dāng)[3-5]，而對于宇航員的進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，重新負(fù)重雖然骨量會有所恢復(fù)，但過程緩慢，重新后1年其骨折發(fā)生率仍高于正常人群[6, 7]。因此對其適當(dāng)干預(yù)預(yù)防骨量丟失或促進(jìn)骨量恢復(fù)至關(guān)重要。

辛伐他汀作為臨床一線降脂類藥物，因?yàn)楸憩F(xiàn)出促進(jìn)骨形成的作用潛能而備受關(guān)注[8-10]。然而，辛伐他汀能否促進(jìn)失重后骨量恢復(fù)尚不明確。尾懸吊大鼠是較為常用的模擬失重造成的應(yīng)力缺失進(jìn)而誘發(fā)骨質(zhì)疏松的模型[11-13]，本研究擬以尾懸吊再負(fù)重大鼠為干預(yù)對象，通過影像學(xué)、骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)、生物力學(xué)等指標(biāo)的分析，觀察辛伐他汀干預(yù)能否促進(jìn)該模型骨量的恢復(fù)。

1 材料和方法

1.1 設(shè)備與材料

5月清潔級雌性SD大鼠24只，(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號SCXK(京)20130002號)，體重(355±20)g。骨密度分析儀(美國Norland公司)，AG-IS 型生物力學(xué)分析系統(tǒng)(日本島津公司)，辛伐他汀(西之達(dá)，浙江瑞邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：所有大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，每組6只：對照組(CL)、尾懸吊非負(fù)重組(UL)、尾懸吊3周再負(fù)重3周組(UL+RL組)、尾懸吊3周再負(fù)重加辛伐他汀干預(yù)3周組(UL+RL+SIM組)；UL+RL+SIM組再負(fù)重同時(shí)給予辛伐他汀干預(yù)(辛伐他汀研磨成粉按照10 mg/mL溶于生理鹽水水制成混懸液，給藥劑量10 mg/kg/d)灌胃。實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周，結(jié)束后所有大鼠采用脫頸法處死，取左側(cè)股骨進(jìn)行骨密度分析，取左側(cè)脛骨行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析；取右側(cè)股骨經(jīng)生物力學(xué)試驗(yàn)分析最大載荷和彈性模量；取右側(cè)脛骨制備組織勻漿，提取RNA和蛋白，Western blot檢測I型膠原(Col I)的表達(dá)。1.2.2 左側(cè)股骨骨密度：應(yīng)用 Norland-XR36 DEXA，采用小物體掃描模式，準(zhǔn)確度 0.01%，掃描速度 60 mm/s，分辨率(resolution)1.0 mm × 1.0 mm，掃描寬度 5.0 cm的參數(shù)值，檢測左側(cè)股骨，采用小動物掃描模式進(jìn)行掃描。掃描結(jié)束后，用儀器自選工具選定興趣區(qū)，讀出每個(gè)標(biāo)本的骨密度值。

1.2.3 左側(cè)脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析：取大鼠左側(cè)脛骨，經(jīng)10%多聚甲醛固定24 h，轉(zhuǎn)入70%乙醇保存，逐級脫水、脫脂并經(jīng)甲基丙烯酸甲酯包埋、硬組織切片機(jī)制備5 μm不脫鈣切片后，行Giemsa染色。用Leica DMLB2熒光/光學(xué)顯微鏡及Leica DC300數(shù)碼攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察與攝取圖像。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測量范圍在距離干骺端生長板1 mm以下4 mm以上的松質(zhì)骨，分內(nèi)、中、外3點(diǎn)隨機(jī)選取圖像錄入微機(jī)，每個(gè)標(biāo)本選取6個(gè)圖像，然后采用Leica QWin多功能彩色病理圖象分析軟件進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)測定，測量面積、長度、距離等相關(guān)數(shù)據(jù)，經(jīng)公式計(jì)算得出骨小梁相對體積比(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.2.4 右側(cè)股骨生物力學(xué)分析:取所有大鼠的右側(cè)股骨行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距(L) 為20 mm，中央垂直(股骨與載荷成90°角)施加載荷，速率10 mm/min，直至股骨斷裂，記錄并分析最大壓縮載荷及彈性模量。

1.2.5 右側(cè)脛骨I型膠原的表達(dá):Real-time PCR：右側(cè)脛骨制成勻漿，Trizol法提取RNA，測定RNA濃度和質(zhì)量后，-80℃凍存?zhèn)溆谩ol I及內(nèi)參GAPDH引物參照以往研究[]，由上海生物生工有限公司合成：Col I引物序列：上游5’-CTCAGCCCT CTGTGCCT-3’;下游：5’-AACCTTCGCTTCCATACT C-3’；GAPDH引物序列：上游5’-ACCATGGTGGAG ATCATCGC-3’；下游：5’-GCCATGACGGTAACCAC GG-3’。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，隨后配置PCR反應(yīng)液：總體積50 μL，包括：Real-time PCR MasterMix 25 μL,引物(10 μmol/L)各2 μL,，cDNA模板2.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃5s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后得出相應(yīng)循環(huán)閾值(Ct)，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組與CL表達(dá)水平比值，作為最終統(tǒng)計(jì)量。

Western blot：右側(cè)脛骨組織勻漿中加入RIPA蛋白裂解液，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存。采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，加入電泳緩沖液、上樣、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2 h、分別加入目的蛋白Col I，和內(nèi)參蛋白β-actin抗體，4℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)二抗，37℃孵育2 h、沖洗、BCIP/NBT 顯色。PVDF膜經(jīng)計(jì)算機(jī)掃描后，自動圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，在同一條件下測定目標(biāo)條帶積分光密度值，計(jì)算出各組樣品目標(biāo)條帶與內(nèi)參(β-actin) 的積分光密度的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立Excel數(shù)據(jù)庫，資料用SPSS 20.0來處理。各組數(shù)據(jù)經(jīng)過Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)和Bartlett方差齊次檢驗(yàn)后，利用單因素方差分析比較各組之間的差異，LSD-t 檢驗(yàn)比較兩組間差異，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 動物死亡情況

各組動物均無死亡，最終各組6只動物均納入最終結(jié)果。

2.2 骨密度

各組骨密度檢測結(jié)果如圖1所示，CL組顯著高于其余3組(P<0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著高于UL組(P<0.05)；UL+RL組與UL+RL+SIM組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(圖1)

圖1 左側(cè)股骨骨密度檢測結(jié)果Fig.1 Results of BMD assessment of the rat left femur Note. *P<0.05 vs. the CL group;#P<0.05 vs. the UL group.

2.3 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果

如圖2所示，各組左側(cè)脛骨松質(zhì)骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)比較結(jié)果如下：

BV/TV：CL組顯著高于其余3組(P<0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著高于UL組(P<0.05)；UL+RL組與UL+RL+SIM組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tb.N： CL組顯著高于其余3組(P< 0.05)，UL組、UL+RL組與UL+RL+SIM組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tb.Th：CL組顯著高于UL組(P<0.05)，其余任意兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tb.Sp：CL組顯著低于其余3組(P<0.05)，UL+RL組和UL+RL+SIM組均顯著低于UL組(P<0.05)；UL+RL組與UL+RL+SIM組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 左側(cè)脛骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)結(jié)果Fig.2 Results of bone histomorphometric analysis of the rat left tibiaNote. *P<0.05 vs. the CL group; #P<0.05 vs. the UL group.

2.4 生物力學(xué)檢測結(jié)果

如圖3所示：各組間兩兩比較，最大載荷和彈性模量差異趨勢相同，兩兩比較結(jié)果：CL組顯著高于其余3組(P<0.05)，其余任意兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 生物力學(xué)檢測結(jié)果Fig.3 Results of biomechanical test of the rat right femursNote. *P<0.05 vs. the CL group

2.5 Col I表達(dá)水平檢測結(jié)果

Real-time PCR：各組Col I mRNA表達(dá)水平及比較結(jié)果如圖4所示，各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Western blot：各組Col I蛋白表達(dá)水平如圖5所示，UL組顯著低于CL組、UL+RL組和UL+RL+SIM組(P<0.05)；其余各組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 Real-time PCR檢測結(jié)果Fig.4 Results of the real-time PCR analysis

圖5 Western blot檢測結(jié)果 A.電泳圖 B. IOD分析結(jié)果Fig.5 Results of western blot. A. Electrophoresis map. B. IOD analysisNote. *P<0.05 vs. CL group; #P<0.05 vs. UL group.

3 討論

因失用造成應(yīng)力缺失可導(dǎo)致成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能失衡，骨骼鈣鹽代謝失衡[14]，進(jìn)而誘發(fā)骨量丟失是長期臥床或制動的臨床患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的主要原因。而正常負(fù)重或一定的額外負(fù)荷可刺激骨形成能力，增加骨量。失重后再重新負(fù)重后，骨形成能力會逐漸恢復(fù)，而在一定時(shí)期內(nèi)，骨吸收能力下降，因此，骨量得以逐漸緩慢恢復(fù)[15]。本研究采用尾懸吊大鼠模擬人類失重誘發(fā)骨質(zhì)疏松模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尾懸吊6周大鼠骨量丟失顯著，而尾懸吊3周再負(fù)重3周大鼠骨量得到一定的恢復(fù)，但仍未達(dá)到正常水平，而辛伐他汀干預(yù)3周并未加速該模型大鼠骨量的恢復(fù)。

尾懸吊大鼠模型是較為常用的模擬失用性骨質(zhì)疏松的動物模型之一，其骨量丟失速度及重新負(fù)重后的骨量恢復(fù)速度與尾懸吊時(shí)間及大鼠鼠齡相關(guān)，3月齡或更年輕大鼠骨丟失及恢復(fù)速度都較快，而6月齡大鼠骨量丟失及恢復(fù)都較慢[16]，本研究采用5月齡大鼠，發(fā)現(xiàn)尾懸吊3周再負(fù)重3周后骨密度、微觀結(jié)構(gòu)以及生物力學(xué)性能均得到一定程度恢復(fù)，但仍未達(dá)到正常對照組水平。

辛伐他汀作為臨床一線降脂類藥物，主要用于高脂血癥和冠心病的治療，而近年對于其非降脂作用主要包括抗癌[17]及促進(jìn)骨形成的研究逐漸成為相關(guān)熱點(diǎn)之一。其成骨作用潛能的探討始于1999年Mundy團(tuán)隊(duì)[18]，隨后相關(guān)學(xué)者開展了相關(guān)的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，除體外直接干預(yù)細(xì)胞的研究結(jié)果較為肯定外[19-21]，臨床試驗(yàn)和體內(nèi)動物研究均未能得到一致結(jié)論[22-24]。有研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀口服可部分阻止卵巢切除大鼠椎體骨質(zhì)量的下降[25]，但不能阻止尾懸吊大鼠骨量丟失[26]，然而，辛伐他汀對于尾懸吊大鼠重新負(fù)重后骨量的恢復(fù)有否促進(jìn)作用，不得而知。本研究采用較高劑量辛伐他汀于尾懸吊大鼠重新負(fù)重同時(shí)開始干預(yù)，3周后與未干預(yù)組大鼠相比，其骨量、微觀結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能等多項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差別。其原因，一方面與藥物作用時(shí)間較短有關(guān)，另一方面，則是由于辛伐他汀灌胃干預(yù)后，作用到骨組織局部的濃度較低，作用相對較弱有關(guān)[27-29]。

而通過對骨組織中I型膠原含量的檢測，我們發(fā)現(xiàn)雖然骨密度檢測結(jié)果提示重新負(fù)重3周大鼠骨礦物質(zhì)含量尚未恢復(fù)到正常水平，但I(xiàn)型膠原水平卻與正常對照組無顯著差別，提示骨吸收活性受抑制，膠原降解減少，而骨形成能力的恢復(fù)使得膠原水平的恢復(fù)早于鈣鹽的礦化，當(dāng)然，這一推測尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜合以上，在本研究劑量和干預(yù)周期下，辛伐他汀未能促進(jìn)尾懸吊再負(fù)重大鼠骨量的恢復(fù)，但由于本研究劑量和干預(yù)時(shí)間較單一，因此，辛伐他汀對該類骨丟失的作用效果尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of simvastatin on bone mass recovery in rats with reloading after tail-suspension

ZHOU Pei-fei1, HU Dong1, ZHANG Yan2, LIU Hao2, TIAN Fa-ming3, Xing Lei2.

(1.Health Center of Xizhou Center, Xiangshan country, Ningbo, Zhejiang 315722, China;2. Affiliated Hospital of the North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000;3. Medical Research Center, North China University of Science and Techonology, Tangshan, Hebei 063000)

Objective To observe the changes of bone mass in reloaded rats after tail-suspension, and the effect and mechanism of simvastatin on this process. Methods Twenty-four 5-month old rats were divided into 4 groups of 6 animals in each group: Control (CL) group without tail-suspension, unloaded (UL) group with tail-suspension for 6 weeks, other 12 rats received tail-suspension for 3 weeks, then reloaded for subsequent 3 weeks (UL+RL) or combined with simvastatin treatment (UL+RL+SIM) at a dose of 10 mg/kg/d. All rats were sacrificed 6 weeks later, and the left femur was used for examination of bone mineral density, left tibia was used for bone histomorphometry analysis, the right femur and tibia were harvested for biomechanical test, and expression levels of type I collagen by real-time PCR and Western blot, respectively. Results 1. BMD of the CL group was significantly higher than those of the other three groups (P<0.05), and was markedly lower than those in the UL+RL and UL+RL+SIM groups (P<0.05). 2. The bone histomorphometry showed that BV/TV in the CL group was significantly higher than those in the other 3 groups, and the UL+RL and UL+RL+SIM groups showed a significantly higher BV/TV than that of UL group (P<0.05). The Tb.Th was significantly higher in the CL group than in the UL group. The Tb.Sp in the CL group was significantly lower than those in the other 3 groups (P<0.05). The UL+RL and UL+RL+SIM groups showed significantly lower Tb.Sp than that of the UL group (P<0.05). 3. Biomechanical test showed that the maximal load and elastic modulus in the CL groups were significantly higher than those of the other three groups (P<0.05). 4. Real-time PCR showed that no significant difference in the mRNA expression level of Col I was found between any two groups. 5. Western blot showed that the IOD of Col I is significantly lower than that in the CL group. Conslusions Bone loss, destruction of trabecular bone micro-architecture and biomechanical properties and reduction of type 1 collagen are present in tail-suspension treated rats, which are partially restored after reloading, and this recovery process is not enhanced by simvastatin treatment.

Simvastatin; Tail-suspension; Bone mineral density; Bone histomorphometry; Biomechanical test; Collagen type I.

河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃(QN20131007)、河北省自然科學(xué)基金(H2013209255)。

周沛飛，主治醫(yī)師，主要從事骨與關(guān)節(jié)退行性疾病的研究。E-mail: peifeizhou@163.com。

邢磊，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail: xlpangdun001@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0020-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.004

2016-11-21