焦 政 朱國琴 周逸嬋 徐 嫻 李曉林 李劍萍 何曉璞 徐 偉 邵 耘 孫為豪#

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化科1(210029)

南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院消化科2 鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科3

熊果酸通過AMPK/STAT3/COX-2信號通路抑制胃癌細胞增殖*

焦 政1朱國琴1周逸嬋1徐 嫻2李曉林1李劍萍3何曉璞1徐 偉1邵 耘1孫為豪1#

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年消化科1(210029)

南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院消化科2鹽城市第一人民醫(yī)院腫瘤科3

背景：前期研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸通過下調環(huán)氧合酶2(COX-2)表達抑制胃癌細胞增殖，但熊果酸抑制COX-2表達的分子機制尚未完全明確。目的：探討單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/信號轉導與轉錄活化因子3(STAT3)/COX-2信號通路在熊果酸抑制胃癌細胞增殖中的作用。方法：構建AMPK-pLVX、AMPK-shRNA、STAT3-pLVX、STAT3-shRNA質粒，分別轉染胃癌細胞株SGC-7901和MKN-45，并給予不同濃度或不同培養(yǎng)時間的熊果酸進行培養(yǎng)。以蛋白質印跡法檢測磷酸化AMPK、磷酸化STAT3和COX-2表達，CCK-8法檢測胃癌細胞增殖。結果：在SGC-7901和MKN-45細胞中，熊果酸呈劑量和時間依賴性地促進AMPK磷酸化、抑制STAT3磷酸化和COX-2表達。敲除AMPK基因能阻斷熊果酸抑制STAT3磷酸化和COX-2表達的作用，過表達STAT3基因能逆轉熊果酸抑制COX-2表達的作用。敲除AMPK基因和過表達STAT3基因均可逆轉熊果酸抑制胃癌細胞增殖的作用。結論：熊果酸可能通過AMPK/STAT3通路下調COX-2表達而抑制胃癌細胞增殖。

熊果酸； 胃腫瘤； AMP活化蛋白激酶類； STAT3轉錄因子； 環(huán)氧化酶2； 細胞增殖

胃癌是嚴重影響我國人民生命健康的惡性腫瘤，術后總體5年生存率約20%，有遠處轉移者的5年生存率不到5%[1]。根治性手術是目前治療胃癌的最有效方法，但近70%的患者確診時已發(fā)生局部或全身轉移，而無法行手術切除。因此，尋求有效的輔助治療藥物十分必要，天然藥物及其提取物的抗癌作用近年已引起國內外學者的廣泛關注。熊果酸具有抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制血管生成和抗突變等生物學活性，已成為腫瘤化學預防的研究熱點[2-3]。本研究的前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧合酶2(COX-2)在胃癌發(fā)生、浸潤和轉移中發(fā)揮重要作用，熊果酸通過下調COX-2表達而抑制胃癌細胞增殖、誘導細胞凋亡。但熊果酸抑制COX-2表達的分子機制目前尚不明確。

單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)在人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色[6-7]，與胃癌的預后密切相關[8]。信號轉導與轉錄活化因子(STAT)是一種重要的信號級聯(lián)分子，參與與細胞周期進程、細胞凋亡、血管生成、腫瘤細胞侵襲和轉移相關靶基因的表達，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用[9]。本研究通過轉染人胃腺癌細胞株敲除或過表達AMPK、STAT3的質粒，旨在探討AMPK/STAT3/COX-2通路在熊果酸抑制胃癌細胞增殖中的作用。

材料與方法

一、主要材料

1. 藥物和試劑：熊果酸由中國藥品生物制品檢定所(北京)提供；BCA試劑盒購自Pierce公司；兔抗人AMPK和磷酸化AMPK(p-AMPK)、COX-2、β-actin單克隆抗體、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體購自Santa Cruz公司。ECL試劑盒購自Amersham公司；無內毒素質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。LipofectamineTM2000轉染試劑購自Invitrogen公司，AMPK-shRNA、AMPK-pLVX、STAT3-shRNA、STAT3-pLVX、NC-shRNA以及NC-pLVX質粒購自漢恒生物科技有限公司。

2. 細胞株：人胃腺癌中分化細胞株SGC-7901購自中國科學院上海細胞生物學研究所，人胃腺癌低分化細胞株MKN-45購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

二、研究方法

1. 藥物配制：熊果酸以DMSO溶解后加入RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度不超過0.1%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 細胞培養(yǎng)：SGC-7901和MKN-45細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，3 d傳代一次。

3. 質粒提?。篈MPK、STAT3特異性shRNA和pLVX寡核苷酸鏈合成以及DNA序列測定由漢恒生物科技有限公司完成，提取純化質粒DNA。

4. 細胞轉染：轉染前24 h，取對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板，以無抗菌藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)至轉染當日細胞融合度達70%～80%，按LipofectamineTM2000轉染試劑說明書步驟行瞬時轉染。將細胞分為空白對照組、陰性對照組和轉染組，分別給予未轉染、轉染NC-shRNA或NC-pLVX、轉染敲除或過表達AMPK和STAT3的質粒(轉染與脂質體配比為 1∶2.5)。轉染后37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育 24 h，熒光顯微鏡下檢測綠色熒光蛋白的表達。

5. 蛋白質印跡法：取對數(shù)生長期細胞，以熊果酸(0、10、20、30 μmol/L)干預24 h，或以30 μmol/L 熊果酸干預培養(yǎng)不同時間(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h)，或轉染24 h后，加或不加30 μmol/L熊果酸干預24 h，收集細胞。預冷的PBS洗滌3次，加入細胞裂解液裂解細胞，4 ℃ 12 000×g離心30 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜，4 ℃封閉 2 h，分別加入兔抗人AMPK、p-AMPK、STAT3、p-STAT3、COX-2和β-actin抗體(工作濃度均為1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，加入二抗，4 ℃孵育2 h。ECL發(fā)光，使用全自動熒光/化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 5200 Multi，上海天能科技有限公司)對蛋白電泳條帶行成像和半定量分析。實驗重復3次。

6. CCK-8法檢測細胞增殖活力：取對數(shù)生長期5×103個細胞，制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細胞貼壁，換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入熊果酸(0、10、20、30 μmol/L)干預24 h，或轉染24 h后，加或不加30 μmol/L 熊果酸干預24 h，然后每孔加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL和CCK-8溶液10 μL，作用2～4 h。以空白對照組調零，于波長450 nm處測定各孔吸光度(A)值。細胞活力=(處理組A值-空白對照組A值)/(非處理組A值-空白對照組A值)，實驗重復3次，每組設5個復孔。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、熊果酸對AMPK、STAT3磷酸化和COX-2表達的影響

熊果酸可呈劑量和時間依賴性地誘導SGC-7901和MKN-45細胞AMPK磷酸化、抑制STAT3磷酸化和COX-2表達(圖1、圖2)。

二、熊果酸通過AMPK抑制STAT3磷酸化和COX-2表達

與空白對照組和陰性對照組相比，AMPK敲除組SGC-7901和MKN-45細胞p-AMPK蛋白表達顯著降低，而AMPK過表達組顯著升高(P<0.05)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

在SGC-7901和MKN-45細胞中，與陰性對照組相比，熊果酸組p-STAT3和COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)，AMPK敲除組p-STAT3和COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.01)。與熊果酸組相比，熊果酸+AMPK敲除組p-STAT3和COX-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)(圖4)。與AMPK過表達組相比，熊果酸+AMPK過表達組p-STAT3和COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖5)。

與SGC-7901或MKN-45細胞0 μmol/L熊果酸組比較，*P<0.05，**P<0.01

與SGC-7901或MKN-45細胞0 h熊果酸比較，*P<0.05，**P<0.01

與SGC-7901或MKN-45細胞空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 敲除或過表達AMPK對胃癌細胞p-AMPK蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

與SGC-7901或MKN-45細胞陰性對照組比較，*P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細胞熊果酸組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖4 敲除AMPK基因對熊果酸抑制胃癌細胞p-STAT3和COX-2蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

與SGC-7901或MKN-45細胞陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細胞AMPK過表達組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖5 過表達AMPK對熊果酸抑制胃癌細胞p-STAT3和COX-2蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

三、熊果酸通過STAT3抑制COX-2表達

與空白對照組和陰性對照組相比，STAT3敲除組p-STAT3蛋白表達顯著降低(P<0.01)，而STAT3過表達組顯著升高(P<0.05)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。

與SGC-7901或MKN-45細胞空白對照組和陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖6 敲除或過表達STAT3對胃癌細胞p-STAT3蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

在SGC-7901和MKN-45細胞中，與陰性對照組相比，熊果酸組COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)，STAT3敲除組COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.01)。與STAT3敲除組相比，熊果酸+STAT3敲除組COX-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與熊果酸組相比，熊果酸+STAT3過表達組顯著升高(P<0.05)(圖7)。

與SGC-7901或MKN-45細胞陰性對照組比較，*P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細胞STAT3敲除組、熊果酸組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖7 敲除或過表達STAT3對胃癌細胞COX-2蛋白表達的影響(蛋白質印跡法)

四、熊果酸抑制胃癌細胞增殖作用的調控

熊果酸呈劑量依賴性地抑制SGC-7901和MKN-45細胞增殖。在SGC-7901和MKN-45細胞中，空白對照組與陰性對照組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，熊果酸組較陰性對照組顯著降低(P<0.05)，熊果酸+AMPK敲除組細胞活力顯著高于熊果酸組(P<0.05)，熊果酸+STAT3過表達組細胞活力顯著高于熊果酸組(P<0.05)(圖8)。

*與SGC-7901或MKN-45細胞空白對照組比較，P<0.01；+與SGC-7901或MKN-45細胞陰性對照組比較，P<0.01；與SGC-7901或MKN-45細胞熊果酸組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖8 敲除AMPK或過表達STAT3對胃癌細胞增殖作用的調控(CCK-8法)

討 論

近年隨著分子生物學技術的發(fā)展以及新化療藥物的應用，胃癌診治水平有了一定程度的提高，但其預后仍不盡如人意。防止腫瘤復發(fā)和轉移的輔助治療越來越受到國內外學者的重視。熊果酸是一種五環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于白花蛇舌草、夏枯草、女貞子和烏梅等天然植物中。動物實驗[3,10]顯示熊果酸在轉基因腫瘤動物模型和裸鼠移植瘤模型中的抑瘤作用顯著，具有良好的臨床應用前景。有研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，熊果酸通過激活AMPK誘導肝癌和膀胱癌細胞凋亡。AMPK是細胞能量代謝的主要調節(jié)器[13]，激活AMPK可誘導胃癌和胰腺癌等腫瘤細胞發(fā)生凋亡[14-15]。白藜蘆醇(resveratrol)的抗腫瘤作用與AMPK活化有關[16]，另一種植物提取物小檗堿(berberine)通過激活AMPK減少COX-2表達而抑制黑色素瘤細胞的轉移潛能[17]。

本研究結果顯示，熊果酸促進胃癌細胞AMPK磷酸化，并抑制STAT3磷酸化和COX-2表達。敲除AMPK基因和過表達STAT3基因均可逆轉熊果酸誘導的COX-2蛋白表達下調，降低熊果酸對胃癌細胞的增殖抑制作用。Yamaoka等[18]證實在大鼠、小鼠以及人類COX-2基因啟動子內含有一種GAS序列，該序列為STAT結合區(qū)域，提示STAT3可能參與COX-2的上游轉錄調節(jié)過程。本研究結果證實，過表達AMPK和敲除STAT3基因可進一步促進熊果酸誘導的COX-2表達下調，從而增強熊果酸對胃癌細胞的增殖抑制作用。熊果酸通過抑制TNF、佛波酯等引起的NF-κB激活作用，抑制NF-κB依賴性COX-2、MMP-9以及cyclin D1表達，從而產生抗腫瘤的作用[19]。文獻報道JAK2/STAT3和PI3K/Akt信號途徑能誘導COX-2的表達[20-21]，而熊果酸能阻斷STAT3通路而抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖[22]。STAT3在各種人胃癌細胞株和胃癌組織中均具有較高的活性，JAK/STAT信號轉導途徑可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用[23]。綜上所述，本研究推測熊果酸通過AMPK/STAT3通路下調COX-2表達進而抑制胃癌細胞增殖。當然，由于細胞內信號轉導機制十分復雜，熊果酸抑制胃癌細胞COX-2表達尚不排除存在其他通路的作用，且不同通路之間可能存在關聯(lián)(如cross-talk等)，全面了解其機制還需行大量而深入的研究。

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(2016-11-07收稿；2016-12-25修回)

Ursolic Acid Inhibits Gastric Cancer Cells Proliferation through AMPK/STAT3/COX-2 Signaling Pathway

JIAOZheng1,ZHUGuoqin1,ZHOUYichan1,XUXian2,LIXiaolin1,LIJianping3,HEXiaopu1,XUWei1,SHAOYun1,SUNWeihao1.

1DepartmentofGeriatricGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210029);2DepartmentofGastroenterology,NanjingFirstHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing;3DepartmentofOncology,YanchengCityNo.1People’sHospital,Yancheng,JiangsuProvince

SUN Weihao, Email: swh@njmu.edu.cn

Ursolic Acid; Stomach Neoplasms; AMP-Activated Protein Kinases; STAT3 Transcription Factor; Cyclooxygenase 2; Cell Proliferation

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.04.004

國家自然科學面上項目(No.81372659)

#本文通信作者，Email: swh@njmu.edu.cn

Background: Previous study has found that ursolic acid (UA) inhibited the proliferation of gastric cancer cells by the down-regulation of cyclooxygenase-2 (COX-2) expression. However, its molecular mechanism is not fully clear. Aims: To investigate the role of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)/signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)/COX-2 signaling pathway in UA-mediated inhibition of gastric cancer cells proliferation. Methods: AMPK-pLVX, AMPK-shRNA, STAT3-pLVX, STAT3-shRNA plasmids were constructed, and then were transfected into human gastric cancer cell lines SGC-7901 and MKN-45, respectively. Gastric cancer cells were cultured with different concentrations of UA for different times. The expressions of phosphorylated AMPK (p-AMPK), phosphorylated STAT3 (p-STAT3) and COX-2 were measured by Western blotting, and cell proliferation was detected by CCK-8 assay. Results: UA dose- and time-dependently increased p-AMPK expression, inhibited p-STAT3 and COX-2 expressions in SGC-7901 and MKN-45 cells. Knockdown of AMPK blocked UA-induced inhibition of STAT3 phosphorylation and COX-2 expression. Overexpression of STAT3 blocked UA-induced down-regulation of COX-2 expression. Knockdown of AMPK and overexpression of STAT3 blocked UA-induced inhibition of proliferation of gastric cancer cells. Conclusions: UA may inhibit the proliferation of gastric cancer cells via down-regulation of COX-2 expression through AMPK/STAT3 pathway.