遲 旭，盛傳倫*，王錦鴻

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 感染科，吉林 長春130033；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸科，廣東 廣州510000)

基于CNPs的熒光DNA生物傳感器對EV71的檢測分析

遲 旭1，盛傳倫1*，王錦鴻2*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 感染科，吉林 長春130033；2.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 呼吸科，廣東 廣州510000)

DNA生物傳感器是一種基于DNA堿基互補配對原則的高靈敏度、高特異性的DNA檢測方法，它通過檢測探針DNA與靶向DNA雜交引起的可檢測信號的改變，從而實現(xiàn)對靶向DNA的檢測[1,2]。目前，已報道了多種基于不同檢測信號的DNA生物傳感器[3]，包括電化學(xué)生物傳感器、壓電生物傳感器[4]和DNA熒光傳感器等。其中，熒光DNA傳感器[5]因具有檢測靈敏度高，操作簡單，抗干擾能力強等優(yōu)點，是目前研究最為廣泛的DNA生物傳感器。

碳納米粒子(carbon nanoparticles，CNPs)為一種納米材料，可作為一種熒光淬滅劑，具有淬滅不同發(fā)射頻率的熒光基團的能力[6]。用納米材料作為熒光淬滅劑，就不用考慮熒光發(fā)射基團和淬滅基團的匹配選擇性。這種方法檢測的原理是：由于這些結(jié)構(gòu)富含π共軛結(jié)構(gòu)，這樣就會靠π-π堆積作用吸附含有自由堿基的單鏈DNA (single-stranded DNA，ssDNA)探針，同時與標記的熒光基團發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而淬滅它的熒光，當目標DNA出現(xiàn)的時候，由于與探針的雜交形成的雙鏈DNA不再有可利用的自由堿基，這樣就會從納米材料上解吸附，熒光信號也會相應(yīng)地增強，從而實現(xiàn)檢測。因此，現(xiàn)就基于CNPs的DNA熒光傳感器對手足口病毒EV71 DNA檢測的可行性及靈敏性進行分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 本實驗所有核酸由生工生物工程(上海)股份有限公司及寶生物工程(大連)有限公司合成；所用核酸序列為PEV71(與手足口病毒EV71有關(guān)的修飾有羧基熒光素FAM熒光基團的單鏈DNA探針)：5’-FAM-AGT CAG TGT GGA AAA TCT CTA GC-3’；T1(與PEV71完全互補的目標DNA)：5’-GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3’；T2(與PEV71互補且存在一個堿基錯配的目標DNA)：5’-GCT AGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3’；T3(與PEV71完全不互補的目標DNA)：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3’。銦錫氧化物導(dǎo)電玻璃(ITO)購自中國深圳南玻公司；實驗所用水均為Millipore Milli-Q 純化過的超純水(電阻率大于18MΩ)。

1.2 主要儀器 本實驗所用儀器為掃描電子顯微鏡(XL30 ESEM FEG掃描電鏡加速電壓20 kV)；能量分散X射線光譜儀(EDX)；透射電子顯微鏡(HITACHIH-8100 EM加速電壓為200 kV)；Cary 500 Scan UV-Vis-NIR光譜儀(Varian，Harbor City，CA，USA)；Zeta PALS，ξ-電勢分析儀(Brookhaven Co.)；熒光光譜用PerkinElmer LS55熒譜儀(PerkinElmer Instruments，UK)；RF-5301PC熒光光譜儀(Shimadzu，Japan)。

1.3 CNPs制備[7]將干凈的燒杯倒扣于蠟燭火焰上收集蠟燭灰，將3 mg收集到的蠟燭灰超生分散于12 ml水/乙醇(1∶1)中。然后在3 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心2 min 去除較大的蠟燭灰顆粒，然后將懸浮液在6 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心2 min，收集黑色沉淀物，將其分散于12 ml水/乙醇(1∶1)中備后用。應(yīng)用電鏡對制備的CNPs進行低倍率及高倍率的掃描。

1.4 樣品制備 在形貌表征前，電沉積后的導(dǎo)電氧化銦錫(Indium tin oxide，ITO)玻璃經(jīng)過二次水以及乙醇沖洗以去掉物理吸附的支持電解質(zhì)，然后用氮氣吹干。樣品的制備通常是將2 μl樣品的懸浮液滴于ITO表面，然后自然干燥。DNA粉末經(jīng)離心、水溶后，用Cary 500 Scan UV-Vis-NIR光譜儀測其在260 nm 波長下的吸光度來定量。ξ-電勢的測量在ξ-電勢分析儀上完成。用于熒光測定的每個樣品的體積均為400 μl。

1.5 EV71病毒DNA序列的檢測 ①分別在有/無CNPs的情況下用PEV71(50 nM)對EV71病毒DNA序列T1(30 nM和300 nM)進行檢測，并同時檢測PEV71、CNPs和PEV71+CNPs。激發(fā)波長為480 nm，記錄熒光發(fā)射光譜及在525 nm波長下的熒光強度。②應(yīng)用PEV71+CNPs體系，對與PEV71完全互補的目標序列T1(300 nM)、與PEV71互補且存在單堿基錯配的目標序列T2(300 nM)以及與PEV71完全不互補的目標序列T3(300 nM)分別進行檢測，并記錄其熒光發(fā)射光譜。③在CNPs濃度分別為0，7，13，20，27，33，40 μl的情況下，應(yīng)用PEV71+CNPs體系對T1進行檢測，并記錄PEV71+CNPs和PEV71+CNPs+T1的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 CNPs的表征 圖1中a和b分別是制備的CNPs的低倍率、高倍率的掃描電鏡照片，從低倍率的掃描電鏡照片可以看出大量的納米顆粒，高倍率的掃描電鏡照片進一步顯示他們的形狀近乎球形，顆粒直徑達25-40 nm之間。這也可由其透射電鏡照片證實(圖1c)。

圖1 CNPs的掃描電鏡照片以及透射電鏡照片

2.2 可行性分析 為了驗證CNPs作為檢測平臺對EV71病毒DNA檢測的可行性，我們選擇了一段EV71病毒的DNA序列來進行實驗。圖2顯示了PEV71在不同條件下的熒光發(fā)射光譜。在沒有CNPs的情況下，PEV71由于存在未淬滅的FAM熒光基團而發(fā)射出強的熒光(曲線a)。然而，當有CNPs出現(xiàn)的時候，熒光強度淬滅了82%(曲線c)。當與T1混合40 min后，PEV71+CNPs體系的熒光得到強烈的增強，恢復(fù)80%的熒光(曲線d)。需要指出的是，在沒有CNPs的情況下自由的PEV71的熒光受T1的影響很小(曲線b)。同樣需要注意的是，由于CNPs本身的弱的熒光(曲線e)會對檢測整體的熒光造成影響，因此，所有在CNPs存在的情況下檢測的熒光都要扣除背景。圖2顯示了PEV71+CNPs體系的熒光變化程度(F/F0-1)隨不同濃度目標的熒光強度化的情況，F(xiàn)和F0分別是該體系有/無T1時在525 nm波長下的熒光強度。在當T1濃度從30 nM增加到300 nM時，F(xiàn)AM熒光強度急劇增強。

2.3 靈敏性分析 通過檢測PEV71+CNPs與T1、T2以及T3反映的熒光強度反映此檢測平臺的靈敏性。如圖3所示，PEV71+CNPs在300 nM T2條件(曲線c)下，其熒光強度F/F0的比值大約在300 nM T1條件(曲線b)下的80%。而PEV71+CNPs不與T3(曲線d)反應(yīng)，其所產(chǎn)生的熒光與空白(曲線a)相差無幾。

2.4 CNPs的不同濃度對檢測的影響 PEV71+CNPs體系中CNPs的濃度對熒光淬滅和恢復(fù)都有一定的影響。圖4顯示了PEV71+CNPs體系中不同CNPs濃度下熒光淬滅和恢復(fù)的情況，其中CNPs的濃度依次為0，7，13，20，27，33，40 μl?？梢?，CNPs濃度與淬滅程度呈正相關(guān)性。然而當CNPs濃度過高時，部分目標序列DNA也會被吸附至CNPs的空白區(qū)域上，不與單鏈DNA探針雜交，致使雜交效率和體系熒光恢復(fù)程度降低。

3 討論

目前可知人類有超過4000種疾病與DNA有關(guān)，因此通過對DNA檢測可以實現(xiàn)對疾病的早期診斷。此外，DNA檢測可以實現(xiàn)對病毒和細菌的種類、亞型診斷，因而對傳染病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。DNA生物傳感器是一種基于DNA堿基互補配對原則的高靈敏度、高特異性的DNA檢測方法，它通過檢測探針DNA與靶向DNA雜交引起的信號改變，從而實現(xiàn)對靶向DNA的檢測。而隨著各種各樣納米材料的出現(xiàn)，探索它們在生物技術(shù)中以醫(yī)學(xué)診斷為目的的應(yīng)用得到了廣泛的研究[8,9]。常見的納米材料主要包括：單壁碳納米管(Single-walled nanotubes，SWNTs)、多壁碳納米管(Multi-walled nanotubes，MWNTs)、石墨烯(Graphene)以及納米碳球(Carbon nanoparticles)等。近年來，納米材料在建立DNA生物傳感器中的作用亦受到關(guān)注。上海物理所的樊春海[10]小組開發(fā)出了一種應(yīng)用石墨烯為熒光基團淬滅劑的熒光增強多元DNA生物傳感器，通過石墨烯表面吸附的三種不同熒光探針實現(xiàn)三元DNA的同時檢測。

圖2 PEV71(50 nM)在不同條件下的熒光發(fā)射光譜 圖3 PEV71(50 nM)在不同條件下CNPs熒光淬滅和 圖4 在不同用量CNPs的情況下PEV71+PEV71+CNPs+T1熒光恢復(fù)的熒光強度

本研究所用的CNPs檢測體系對病毒DNA進行檢測的原理主要分為兩步：(1)由于單鏈核酸探針未配對堿基與富含π鍵的CNPs發(fā)生π-π堆積而把單鏈探針DNA吸附到表面，同時由于與探針標記的熒光基團發(fā)生電子轉(zhuǎn)移而引起熒光的淬滅。(2)在有目標DNA序列出現(xiàn)的情況下，由于與探針DNA雜交后形成雙鏈DNA中未配對堿基的消失，CNPs對雙鏈DNA吸附減弱，探針與目標DNA形成的雙鏈從CNPs表面脫離，同時恢復(fù)標記的熒光基團的熒光，從而利用增強的熒光來實現(xiàn)目標DNA序列的檢測。

我們根據(jù)Sun等[7]報道的從蠟燭灰中分離得到CNPs，并證實了能夠建立基于CNPs的DNA熒光生物傳感器，CNPs/DNA體系可有效地應(yīng)用熒光檢測DNA，也有望用作監(jiān)測其他生物分子之間相互作用的探針。CNPs能夠吸附單鏈DNA并具備強淬滅熒光基團的能力，當PEV71吸附于CNPs上時，熒光強度明顯降低。而這種吸附并不影響探針PEV71與目標序列的雜交，當PEV71+CNPs與T1混合后，熒光得到恢復(fù)，目標序列的檢測濃度可達30 nM至300 nM，隨目標序列濃度升高，熒光強度也急劇升高。同時該體系具有很高的靈敏性和重復(fù)性，可區(qū)分單堿基錯配。同時，本研究也就CNPs的濃度變化對DNA檢測的影響進行了初步研究。CNPs濃度雖與猝滅程度呈正相關(guān)，但其濃度過高可造成雜交效率和熒光恢復(fù)程度的降低，故此我們推薦選擇20 μl CNPs用于DNA檢測。

本研究以納米材料為檢測平臺利用熒光方法實現(xiàn)對生物分子的檢測，建立了一種靈敏且具選擇性的DNA傳感器，實現(xiàn)了對DNA的靈敏檢測，為DNA檢測精細化、便捷化提供了理論及實驗依據(jù)。

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吉林省社會發(fā)展領(lǐng)域重點科技支撐項目(2011456)

1007-4287(2017)04-0702-03

2016-07-22)

*通訊作者