張海濤,饒艷偉*,賈桂風(fēng)

(1.吉林省人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130021； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑Salubrinal在大鼠急性肺損傷的作用機(jī)制的研究

張海濤1,饒艷偉1*,賈桂風(fēng)2

(1.吉林省人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130021； 2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科)

急性肺損傷是有各種誘因(嚴(yán)重感染、膿毒癥、外傷、休克、有害氣體吸入等)導(dǎo)致的急性以及進(jìn)行性的缺氧性呼吸衰竭。其臨床表現(xiàn)為起病急，常規(guī)吸氧后低氧血癥難以糾正，雙肺可聞及濕啰音等。目前臨床上主要以對癥治療、呼吸支持和液體療法為主[1]。但是也有通過糖皮質(zhì)激素、前列腺素E1、環(huán)氧化酶抑制劑進(jìn)行治療。Salubrinal為選擇性抑制elF2a去磷酸化的抑制劑，是在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而引起的凋亡中的化合物篩選出的小分子化合物，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其可以選擇性誘導(dǎo)elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最終可以保護(hù)細(xì)胞避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡。Boyce M的研究認(rèn)為Salubrinal引起細(xì)胞中GRP78表達(dá)增高，認(rèn)為Salubrinal可能上調(diào)GRP78來避免細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的發(fā)生[2,3]。本研究以急性肺損傷大鼠為研究對象，通過觀察大鼠血清中谷胱甘肽的水平和肺組織中Nrf2蛋白的表達(dá)，闡明選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal在急性肺損傷大鼠肺損傷中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品及主要試劑

脂多糖(美國 Sigma 公司)，Salubrinal (Sal，美國 Sigma 公司)，Nrf2蛋白抗體(美國 Santa Cruz 公司)，3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、谷胱甘肽試劑盒(福州邁新生物制品公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±10)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK-(吉)2008-0005。將大鼠隨機(jī)分為對照組、 急性肺損傷組、 急性肺損傷 Sal 1.0治療組，每組16只。

1.3 動(dòng)物模型制備及處理

① 對照組：一次性灌胃1 mL生理鹽水；每日2次腹腔注射1 mL生理鹽水。② 急性肺損組(ALI)：一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射。③ Sal 1.0治療組，一次性給予5 mg/kg 脂多糖靜脈注射造模后，腹腔注射1.0 mg/kg/天 Salubrinal。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

造模7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，留取肝素化的大鼠尾靜脈血。取肺組織-80 ℃保存。同時(shí)右肺中葉應(yīng)用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片等過程，最后給予蘇木素-伊紅(HE)染色。冷凍肺組織行蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)。

1.4.1 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 取肺組織切片，經(jīng)脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水、透明、封固光鏡下觀察。

1.4.2 Western Blot檢測肺組織Nrf2蛋白表達(dá) 提取肺組織總蛋白，Bio-Rad 法測定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量試劑盒說明書步驟操作，測定Nrf2樣品的蛋白濃度。用Image J圖像處理軟件計(jì)算各條帶灰度值，分析Nrf2蛋白的表達(dá)情況。以目的蛋白與內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)觀察

急性肺損傷組大鼠肺組織部分損傷，出現(xiàn)了大量的炎癥及局部肺組織出血明顯，鏡下觀察有塌陷的肺泡壁，肺泡腔擴(kuò)大，肺泡隔顯著增厚；而Sal 治療組肺組織病理改變較急性肺損傷組明顯減輕(圖1)。

圖1 急性肺損傷大鼠肺組織HE染色(×40)

2.2 Western Blot檢測Nrf2蛋白表達(dá)

與對照組相比，急性肺損傷組Nrf2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與急性肺損傷組相比，Sal組Nrf2蛋白表明顯達(dá)增高，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 急性肺損傷大鼠的肺組織中Nrf 2蛋白的表達(dá)

2.3 血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)

急性肺損傷大鼠Sal 治療組的血清中GSH/GSSG值(3.71±0.06)與急性肺損傷組(1.98±0.16)相比明顯增高(P<0.05)。

3 討論

急性肺損傷是有各種誘因?qū)е碌募毙砸约斑M(jìn)行性的缺氧性呼吸衰竭。其臨床表現(xiàn)為起病急，常規(guī)吸氧后低氧血癥難以糾正，雙肺可聞及濕羅音等。研究發(fā)現(xiàn)其病死率仍然較高，依照1994年頒布的ALI/ARDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)后，不同國家和地區(qū)的統(tǒng)計(jì)顯示其病死率仍然為30%-40%[4]。但是在中國上海的統(tǒng)計(jì)住院病死率68.5%[5]，北京地區(qū)住院病死率為52.0%[6]。所以，急性肺損傷的病死率在我國總體水平仍然很高，需要進(jìn)行相關(guān)的藥物創(chuàng)新。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對急性肺損傷大鼠進(jìn)行干預(yù)觀察，為臨床治療提供一個(gè)新的方向。

Salubrinal為選擇性抑制elF2a去磷酸化的抑制劑，是在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而引起的凋亡中的化合物篩選出的小分子化合物，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其可以選擇性誘導(dǎo)elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最終可以保護(hù)細(xì)胞避免內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的凋亡。Boyce M.的研究認(rèn)為Salubrinal引起細(xì)胞中GRP78表達(dá)增高，認(rèn)為Salubrinal可能上調(diào)GRP78來避免細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的發(fā)生[2,3]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)通過給予Salubrinal處理急性肺損傷大鼠后，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織形態(tài)有明顯的改變。其中在孫明莉等[7]在百草枯中毒大鼠經(jīng)過Salubrinal處理后，發(fā)現(xiàn)Salubrinal也能明顯改變其肺組織的形態(tài)。同時(shí)我們也檢測了血清中的還原型谷胱甘肽的水平，發(fā)現(xiàn)與急性肺損傷組相比，Sal治療組的還原型谷胱甘肽的水平明顯增高。這說明Salubrinal能提高大鼠血清中的抗氧化水平，對體內(nèi)產(chǎn)生保護(hù)性作用。進(jìn)一步的研究我們檢測了大鼠肺組織的Nrf2蛋白表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)與急性肺損傷組相比，Sal治療組的Nrf2蛋白表達(dá)明顯增高。其中研究發(fā)現(xiàn)在正常的細(xì)胞中 Nrf2蛋白水平表達(dá)很低，當(dāng)細(xì)胞在外界刺激后處于應(yīng)激的狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞中的Nrf2調(diào)節(jié)因子 Keap1在半胱氨酸殘基直接修飾作用后，改變了對 核內(nèi)Nrf2 調(diào)節(jié)作用，保持了Nrf2穩(wěn)定性，之后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活抗氧化酶以及解毒基因的表達(dá)。保證Nrf2 蛋白的穩(wěn)定性對于應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2途徑的激活起到了主要的作用[8]。因此，在細(xì)胞處于應(yīng)激的條件下，Keap1-Nrf2 途徑通過一種去抑制作用促使 Nrf2 從 Keap1 的抑制作用中解放出來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而提高細(xì)胞的抗氧化水平。所以，在本研究中我們認(rèn)為Salubrinal可能是通過活化 Keap1-Nrf2 途徑，降低急性肺損傷大鼠的ROS水平，提高了其抗氧化水平起到保護(hù)性作用，有可能為臨床的急性肺損傷的患者提供一種新的治療策略。

[1]Umberto Meduri G,Bell W,Sinclair S,et al.Pathophysiology of acute respiratory distress syndrome.Glucocorticoid receptor-mediated regulation of inflammation and response to prolonged glucocorticoid treatment[J].Presse Med,2011 ,40:543.

[2]Boyce M,Bryant KF,Jousse C,et al.A selective inhibitor of eIF2-a phosphorylation protects cells from ER stress[J].Science,2005,307 (5711):935.

[3]Chen JJ.Translational control by heme-regulated eIF2α kinase during erythropoiesis[J].Curr Opin Hematol,2014,21:172.

[4]Ranieri V M, Rubenfeld G D, Thoposon B T,et al.Acute respiratory distress syndrome (ARDS):The Belin Definition[J].Jama,2012,307:2526.

[5]Lu Y ,Song Z,Zhou X ,et al.A 12-month clinical survey of incidence and outcome of acute respiratory distress syndrome in Shanghai intensive care units[J].Intensive Care Med,2004,30(12):2197.

[6]北京市科委重大項(xiàng)目 MODS 課題組.1998-2003 年北京地區(qū)重癥加強(qiáng)治療病房急性呼吸窘迫綜合征的臨床流行病學(xué)調(diào)查[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2007,19(4):201.

[7]李海峰,邢寶鵬,權(quán)玉蘭,等.選擇性磷酸酶抑制劑Salubrinal對急性百草枯中毒大鼠肺組織細(xì)胞自噬和凋亡的影響.中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2014,26:671.

[8] KatohY,Iida K,Kang MI,et al.Evolutionary conserved N-terminal domain of Nrf2 is essential for the Keap1-mediated degradation of the protein by proteasome.[J].Arch.Biochem.Biophys,2005,433:342.

吉林省衛(wèi)生計(jì)生委資助(2015SZC13)

1007-4287(2017)04-0696-03

2016-06-11)

*通訊作者