季禹喬，孫明忠*，朱 暉，唐慶國(guó)，王文才，王 進(jìn)，張靈芝，吳芹芹

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.心胸外科，江蘇 鹽城224001)

血清miRNA-21與腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌的診斷價(jià)值

季禹喬1，孫明忠1*，朱 暉1，唐慶國(guó)1，王文才2，王 進(jìn)2，張靈芝1，吳芹芹1

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.心胸外科，江蘇 鹽城224001)

目的 探討miRNA-21與CEA、CYFRA21-1、NSE對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的診斷價(jià)值。方法 以50例NSCLC患者作為病例組、60例健康人為對(duì)照組，檢測(cè)所有研究對(duì)象的血清癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及miRNA-21(miR-21)水平。結(jié)果 病例組血清CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21診斷NSCLC患者的受試者特征工作曲線(ROC曲線)下面積(AUC)分別為0.918、0.826、0.853、0.866，以CEA診斷效能最高。TNMⅠ-Ⅱ期的NSCLC患者血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)。Logistic多元回歸分析結(jié)果顯示，早期NSCLC(TNMⅠ-Ⅱ期)的發(fā)生與血清CYFRA21-1水平、血清miR-21水平均具有相關(guān)性(P<0.05)。CEA、NSE、CYFRA21-1、miR-21診斷早期NSCLC的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高。單獨(dú)應(yīng)用血清CYFRA21-1水平檢測(cè)、單獨(dú)應(yīng)用血清miR-21水平檢測(cè)和聯(lián)合應(yīng)用兩種血清標(biāo)志物檢測(cè)的AUC分別為0.843、0.872和0.909。結(jié)論 NSCLC患者血清miRNA-21與CEA、CYFRA21-1、NSE表達(dá)異常，血清miR-21水平對(duì)于早期NSCLC的診斷效能較高，可作為輔助診斷的重要血清標(biāo)志物，將其與血清CYFRA21-1水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可提高其診斷效能。

微小RNA-21；腫瘤標(biāo)志物；癌胚抗原；細(xì)胞角蛋白片段21-1；神經(jīng)元特異性烯醇化酶；非小細(xì)胞肺癌；診斷

(ChinJLabDiagn,2017,21:0576)

在基因表達(dá)和進(jìn)化過(guò)程中，高度保守、性質(zhì)穩(wěn)定的微小RNA(miRNA)在調(diào)節(jié)致癌基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要的作用，與細(xì)胞增殖、分化以及惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。研究表明，miRNA參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，具有與原癌基因或腫瘤抑制基因相似的作用，在肺癌組織中miRNA有特定的表達(dá)譜，參與了調(diào)節(jié)腫瘤血管生成等多個(gè)過(guò)程[1，2]。因此，miRNAs可作為生物學(xué)標(biāo)志物用于NSCLC的早期診斷、靶向治療及臨床預(yù)后評(píng)價(jià)。本研究針對(duì)血清miRNA-21 (miR-21)及CEA、NSE、CYFRA21-1等血清標(biāo)志物檢測(cè)在早期NSCLC診斷中的價(jià)值進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2015年1月我院收治的NSCLC患者50例作為病例組，納入患者均經(jīng)行肺癌腫瘤切除術(shù)，術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)為NSCLC，術(shù)前均未接受過(guò)放、化療治療。其中，男38例、女12例，年齡為45-81歲，平均年齡為(60.8+8.7)歲，鱗癌29例、腺癌21例，TNM分期為：Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期19例，Ⅳ期9例。同期選取60例體檢合格者為對(duì)照組，其中，男47人、女13人，年齡為42-78歲，平均(62.6+8.8)歲。兩組研究對(duì)象在年齡、性別構(gòu)成等方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究納入的所有研究對(duì)象均對(duì)研究方案知情并簽署知情同意書(shū)，研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 觀察指標(biāo)

采集研究對(duì)象的空腹外周靜脈血標(biāo)本(病例組于入院次日，對(duì)照組于體檢當(dāng)日)，血液樣本經(jīng)常規(guī)離心后分離血清，應(yīng)用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司生產(chǎn))采用雙抗體夾心磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法對(duì)血清標(biāo)本中的CEA、NSE及CYFRA21-1水平進(jìn)行檢測(cè)和比較，試劑盒為儀器配套試劑盒，嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明步驟進(jìn)行操作；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法對(duì)血清標(biāo)本中的miR-21表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和比較，具體步驟為應(yīng)用RNA提取試劑盒(美國(guó)ABI公司生產(chǎn))于采集血樣7天內(nèi)提取總RNA，提取后立即置于-80℃冰箱內(nèi)保存，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ABI公司生產(chǎn))對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為15 μL，包括100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、MultiScribe Reverse Tran scriptase 1 μl、10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μl、RNase Inhibitor 0.19 μl、無(wú)菌注射用水4.16 μl、以無(wú)菌注射用水1∶1稀釋后的總RNA 5 μl、RT primer 3 μl，引物序列通過(guò)查詢Sanger microRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，反轉(zhuǎn)錄條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃5 min，4 ℃恒溫，獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即應(yīng)用RT-PCR系統(tǒng)(美國(guó)ABI公司生產(chǎn))進(jìn)行定量檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為20 μl，包括Taq Man Universal Master MixⅡ 10 μl，無(wú)菌注射用水4 μl，Taqman MicroRNA Assay 1 μl，以無(wú)菌注射用水1∶1稀釋后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5 μl。PCR檢測(cè)反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。通過(guò)PCR自帶軟件生成基線和閾值后，以miR-16為內(nèi)參，直接讀取各樣本中的miR-21、miR-16的循環(huán)閾值(Ct值)，即擴(kuò)增產(chǎn)物量達(dá)到臨界閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，△Ct為miR-21的Ct 值與miR-16的Ct 值的差值，以2-△△Ct表示miR-21的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包建立數(shù)據(jù)庫(kù)，計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)的形式表示，兩組之間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，計(jì)數(shù)資料采用百分率的形式表示。血清標(biāo)志物診斷效能的比較應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC)下面積(AUC)進(jìn)行比較，取Youden指數(shù)最大時(shí)的數(shù)值作為最佳篩查陽(yáng)性界值(cut-off)值，并據(jù)此對(duì)血清標(biāo)志物單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、誤診率、漏診率、約登指數(shù)進(jìn)行計(jì)算和比較。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對(duì)象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比較

病例組患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均顯著高于對(duì)照組，兩組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。不同性別、年齡、病理類(lèi)型的NSCLC患者的血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的差異及不同臨床分期的NSCLC患者的血清CEA、NSE水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者，兩者之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組研究對(duì)象血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的比較

表2 NSCLC患者臨床特征與血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平的相關(guān)性

2.2 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平檢測(cè)針對(duì)NSCLC的診斷效能比較

四種血清標(biāo)志物診斷NSCLC的AUC分別為0.918、0.826、0.853、0.866，CEA診斷NSCLC的效能最高，見(jiàn)圖1A、表3。

表3 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1檢測(cè)對(duì)NSCLC的診斷效能比較

剔除晚期肺癌(TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期)病例數(shù)據(jù)后，CEA、NSE、CYFRA21-1 、miR-21診斷早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高，見(jiàn)圖1B、表4；應(yīng)用Logistic多元回歸分析對(duì)四種血清標(biāo)志物水平與早期NSCLC的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，早期NSCLC的發(fā)生與血清CYFRA21-1水平(OR=1.076)和血清miR-21水平(OR=2.473)具有相關(guān)性(Waldχ2=4.025、9.153，P<0.05)，見(jiàn)表5；將應(yīng)用血清CYFRA21-1水平與血清miR-21水平聯(lián)合檢測(cè)與單獨(dú)應(yīng)用其中之一進(jìn)行檢測(cè)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用血清CYFRA21-1水平檢測(cè)、單獨(dú)應(yīng)用血清miR-21水平檢測(cè)和聯(lián)合應(yīng)用兩種標(biāo)志物檢測(cè)的AUC分別為0.843、0.872和0.909，見(jiàn)圖1C、表6。

A) 診斷NSCLC；B)早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)；C) 血清miR-21、CYFRA21-1水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷早期NSCLC

檢測(cè)變量AUC標(biāo)準(zhǔn)誤顯著性95%可信區(qū)間下限上限CEA0.9180.0340.0000.8510.985NSE0.8260.0410.0000.7470.906CYFRA21-10.8530.0370.0000.7800.925miRNA-210.8660.0360.0000.7960.936

表4 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平檢測(cè)針對(duì)早期NSCLC的診斷效能比較

表5 血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平與早期NSCLC相關(guān)性的多因素分析

表6 血清miR-21、CYFRA21-1水平單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于早期NSCLC的診斷效能比較

3 討論

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，在肺癌病例中，約80%為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病例。近年來(lái)，NSCLC發(fā)病率出現(xiàn)了逐年增高的趨勢(shì)，無(wú)論是在我國(guó)還是全世界范圍，NSCLC均已成為致死率最高的腫瘤[3-5]。在吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼等新型分子靶向藥物相繼進(jìn)入臨床應(yīng)用后，含鉑兩藥聯(lián)合方案及靶向治療方案有一定程度上提高了晚期NSCLC的療效[6-8]。盡管如此，晚期NSCLC患者的生存率并未得到顯著的提升，總體預(yù)后仍然較差[3-5]，因此，提高早期NSCLC的診斷率仍然是改善NSCLC患者預(yù)后的關(guān)鍵手段。經(jīng)支氣管鏡，縱隔鏡或胸腔穿刺進(jìn)行組織活檢是診斷NSCLC的最可靠方法，但這些有創(chuàng)性檢查在應(yīng)用時(shí)具有較多的禁忌癥，不能作為早期篩查和連續(xù)監(jiān)測(cè)的手段。血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)具有操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、無(wú)創(chuàng)傷、樣本易獲得、可連續(xù)監(jiān)測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，一直是早期NSCLC輔助診斷手段研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前，臨床上已經(jīng)先后探討癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、糖蛋白-199(CA-199)、細(xì)胞角蛋白5/6 (CK5/6)、細(xì)胞角蛋白HMW(CK-HMW)、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(TTF-1)和細(xì)胞角蛋白8/18(CK8/18)等診斷價(jià)值，但尚未尋找到一種可以單獨(dú)用于早期NSCLC診斷的可靠指標(biāo)[9]，聯(lián)合檢測(cè)已成為提高血清標(biāo)志物針對(duì)早期NSCLC診斷效率的主要手段。

本次研究結(jié)果顯示，病例組血清miR-21、CEA、NSE、CYFRA21-1水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，這說(shuō)明NSCLC患者血清miR-21及常規(guī)血清標(biāo)志物的異常表達(dá)。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21診斷NSCLC的AUC分別為0.918、0.826、0.853、0.866，提示CEA是NSCLC發(fā)生的最有效指標(biāo)。CEA是一種廣譜性腫瘤標(biāo)志物，可在多種腫瘤中表達(dá)，而且還與腫瘤惡性化具有密切的相關(guān)性，在臨床上主要用于輔助診斷惡性腫瘤、判斷腫瘤分期和病變程度、監(jiān)測(cè)治療和預(yù)報(bào)復(fù)發(fā)等方面。研究表明，NSCLC患者血清CEA水平與其EGFR基因突變率具有相關(guān)性，血清CEA水平可作為指導(dǎo)NSCLC靶向治療的指標(biāo)[10]。血清CEA水平也是影響NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素，NSCLC患者CEA水平的升高與其術(shù)后生存率的下降相關(guān)，血清CEA水平的高低可用于預(yù)測(cè)手術(shù)切除腫瘤后的NSCLC患者的預(yù)后，對(duì)于難以獲得組織標(biāo)本的復(fù)發(fā)晚期NSCLC患者，其水平也可作為預(yù)測(cè)EGFR-TKI藥物療效的參考指標(biāo)[11]。盡管如此，本研究未觀察到不同TNM分期患者血清CEA水平差異表達(dá)，這說(shuō)明CEA對(duì)早期NSCLC的指示作用并不顯著。

本次研究結(jié)果顯示，TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期的NSCLC患者的血清miR-21水平、血清CYFRA21-1水平均低于TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期的患者(P<0.05)，Logistic多元回歸分析結(jié)果顯示，早期NSCLC(TNM分期為Ⅰ-Ⅱ期)的發(fā)生與血清CYFRA21-1水平和血清miR-21水平具有相關(guān)性(P<0.05)。血清CEA、NSE、CYFRA21-1和miR-21診斷早期NSCLC的AUC分別為0.752、0.806、0.843、0.882，miR-21診斷早期NSCLC的效能最高，單獨(dú)應(yīng)用血清CYFRA21-1水平檢測(cè)、單獨(dú)應(yīng)用血清miR-21水平檢測(cè)和聯(lián)合應(yīng)用兩種血清標(biāo)志物檢測(cè)的AUC分別為0.843、0.872和0.909，這說(shuō)明在本研究選取的四種血清標(biāo)志物中，miR-21、CYFRA21-1的表達(dá)水平與患者的TNM分期具有一定的相關(guān)性，對(duì)于早期NSCLC的診斷具有一定的輔助作用，在單獨(dú)檢測(cè)時(shí)，血清miR-21水平診斷早期NSCLC的效能要高于其它標(biāo)志物，可作為輔助診斷早期NSCLC的重要血清標(biāo)志物，而將血清miR-21水平和血清CYFRA21-1水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可提高其診斷效能。既往研究證實(shí)，肺癌組織中miR-21的表達(dá)水平顯著高于正常肺組織，腫瘤組織miR-21高表達(dá)的肺癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率顯著高于miR-21低表達(dá)的患者，且患者生存期也會(huì)明顯降低[12]。根據(jù)一項(xiàng)針對(duì)8篇研究文獻(xiàn)、600例病例，440例對(duì)照研究對(duì)象的Meta分析結(jié)果[13]，血清miR-21診斷早期肺癌的合并敏感度為72%，合并特異度為84%，AUC為0.898。與該研究相比較，本研究結(jié)果在敏感度估算方面存在一定的差異，這種差異可能與本研究樣本量少于Meta分析研究有關(guān)，也可能與該研究選取的研究對(duì)象包含其它類(lèi)型肺癌病例有關(guān)。

CYFRA21-1是一種上皮來(lái)源的新型腫瘤標(biāo)記物，血清CYFRA21-1水平與肺癌患者的影像學(xué)疾病控制(DC)和無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)等指標(biāo)具有相關(guān)性[14]，可敏感地反映影像學(xué)腫瘤體積大小的變化，可作為評(píng)價(jià)進(jìn)展期NSCLC患者化療療效的替代指標(biāo)[15]。本研究中未得出NSE在診斷NSCLC特別是早期NSCLC方面具有優(yōu)勢(shì)的結(jié)果。作為腫瘤標(biāo)志物，NSE主要是與神經(jīng)母細(xì)胞瘤和小細(xì)胞肺癌(SCLC)特異性相關(guān)，而在NSCLC診斷方面的作用則不及其它一些腫瘤標(biāo)志物[16]，在臨床上經(jīng)常將NSE與CEA、CYFRA21-1、CA199、糖蛋白抗原125(CA125)、鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC)等進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，用于各類(lèi)肺癌患者的鑒別診斷、化療療效評(píng)價(jià)和預(yù)后評(píng)價(jià)[16]。

綜上所述，NSCLC患者表現(xiàn)為血清miR-21及血清腫瘤標(biāo)志物的異常表達(dá)，血清miR-21水平對(duì)于早期NSCLC的診斷效能較高，可作為輔助診斷的重要血清標(biāo)志物，將其與血清CYFRA21-1水平進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，可提高其診斷效能。

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Serum miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE in Diagnosis of Early Non-Small Cell Lung Cancer

JIYu-qiao,SUNMing-zhong,ZHUHui,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,TheAffiliatedYanchengHospitalofSoutheastUniversityMedicalCollege,Yancheng224001,China)

Objective To compare serum miRNA-21 and serum tumor markers detection in diagnosis of early non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Fifty patients with NSCLC were treated as the case group and 60 cases of healthy people were treated as the control group.The serum carcinoma embryonic antigen (CEA) and cytokeratin protein fragment 21-1 (CYFRA21-1),neuron specific enolase (NSE) and miRNA (miR-21) levels were detected and analyzed in all subjects.Results The serum miR-21,CEA,NSE,CYFRA21-1 levels in the case group were significantly higher than those in the control group (P<0.01).The areas under receiver operating characteristic curve (ROC curve) of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.918,0.826,0.853 and 0.866 in diagnosis of NSCLC.The efficiency of CEA in diagnosis of NSCLC was the highest.The serum miR-21 and CYFRA21-1 level of the NSCLC patients with TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage were lower than those of Ⅲ-Ⅳ stage (P<0.05).Logistic multivariate regression analysis showed that the incidence of early NSCLC (TNM stage of Ⅰ-Ⅱ stage) was correlated with the serum CYFRA21-1 level and the serum miR-21 level (P<0.05).AUC of serum CEA,NSE,CYFRA21-1 and miR-21 were 0.752,0.806,0.843,0.882 in diagnosis of early NSCLC.The efficiency of miR-21 was the highest in diagnosis of early NSCLC.The AUC were 0.843,0.872 and 0.909 for detection of serum CYFRA21-1 only,miR-21 only and the combination detection.Conclusion The miRNA-21 and CEA,CYFRA21-1,NSE are abnormal expression in patients with NSCLC.The efficiency of serum miR-21 detection is higher in diagnosis of early NSCLC and can serve as a serum marker.The combination detection of serum miR-21 and CYFRA21-1 can improve efficiency.

miroRNA-21;tumor markers;carcinoma embryonic antigen;cytokeratin protein fragment 21-1;neuron specific enolase;non-small cell lung cancer;diagnosis

江蘇省鹽城市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK2013073)

1007-4287(2017)04-0576-06

R734.2

A

2016-09-16)

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