陳 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，張 佩，朱源志，蘇 遠(yuǎn)，陳興華，何純蓮

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410006）

優(yōu)選維Vitamin C測(cè)定方法在果蔬中的應(yīng)用

陳 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，張 佩，朱源志，蘇 遠(yuǎn)，陳興華，何純蓮

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙410006）

目的：為完善藥品、食品中維生素C含量測(cè)定方法，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食，找到一種準(zhǔn)確快速測(cè)定維生素C含量的方法。方法：采用直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法測(cè)定維生素C的含量，系統(tǒng)比較維生素C含量測(cè)定的方法優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)果：直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法（鄰苯二胺體系、苯甲酸體系）測(cè)得維生素C片中維生素C的含量絕對(duì)誤差分別為0.094mg/mL，0.095mg/mL，0.357mg/mL，0.120mg/mL，0.009mg/mL。結(jié)論：在苯甲酸體系，采用熒光分光光度法測(cè)得維生素C的含量準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)易，方便應(yīng)用于果蔬中 維生素C測(cè)定。

維生素C；熒光分光光度法；紫外分光光度法；2，6-二氯酚靛酚法

維生素C（VitaminC）是人體必需營(yíng)養(yǎng)素，其藥理及多種生理活性已得到證實(shí)［1-4］，作為純粹藥物或食品添加劑已被廣泛應(yīng)用。然而，研究表明過(guò)高劑量的VC（達(dá)2g/d）可能增加細(xì)胞DNA對(duì)H2O2或其它有害物質(zhì)損害的敏感性［5］，同時(shí)對(duì)DNA可能產(chǎn)生多方面的損傷，如阻礙DNA修復(fù)合成、抑制DNA半保留復(fù)制、破壞核苷酸、斷裂DNA、引起基因突變或染色體損傷等，因此建立快速準(zhǔn)確測(cè)定VC的方法尤為重要。目前維生素 C含量的測(cè)定方法很多，有碘滴定法、高效液相色譜法、2，6-二氯酚靛酚法、極譜法、2，4-二硝基苯肼比色法、熒光分光光度法、電化學(xué)法、鉬藍(lán)比色法、過(guò)氧化酶法等。但這些方法都有一定的缺陷，如中國(guó)藥典中采用的置換碘量法在測(cè)定深色樣品時(shí)，準(zhǔn)確度欠佳［6］；反相HPLC 法用于復(fù)雜基體的樣品測(cè)定比較困難［7］；2，6-二氯酚靛酚法利用 DCIP 染料滴定果蔬提取液，滴定終點(diǎn)為紅色，如果待測(cè)果蔬呈紅色，提取液本身顏色會(huì)干擾滴定終點(diǎn)的觀(guān)察，若對(duì)果蔬提取液進(jìn)行脫色處理后利用該法測(cè)定深色果蔬中維生素C的含量，準(zhǔn)確度和精密度依然欠佳。極譜法測(cè)定實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用汞蒸氣有毒，且毛細(xì)管易堵塞［8］。酶分析法成本低廉，快速，且不需要對(duì)被分析物預(yù)先提純，由于目前提高常規(guī)法自動(dòng)化程度的趨勢(shì)限制酶分析法的廣泛應(yīng)用［9］等。

本研究通過(guò)對(duì)維生素C含量測(cè)定方法進(jìn)行系統(tǒng)比較研究，旨在找到一種準(zhǔn)確快速維生素C分析方法，完善藥典和食品中維生素C含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食。

1 資料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

1.1.1 儀器 紫外分光光度計(jì)：LabTech BlueStar，電熱恒溫水浴鍋：DK-98-1A型，天津市泰斯特儀器有限公司，熒光分光光度計(jì)：LS-45/55（美國(guó)PE公司），高速冷凍離心機(jī)（thermo scientific FRESC017）。

1.1.2 試劑 抗壞血酸，無(wú)水乙酸鈉，十六烷基三甲基溴化銨，冰醋酸，乙酸鈉，硼酸，鄰苯二胺，碘化鉀，氧化砷，碳酸氫鈉，2，6-二氯靛酚鈉，鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），硫酸（株洲磺化玻有限公司），偏磷酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），高嶺土，苯甲酸（上海山浦有限公司），硫酸銅（天津市博迪化工有限公司）。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水。

1.1.3 材料

1.1.3.1 維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密稱(chēng)定1.0g維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，溶解，定容至1000mL容量瓶，得到1.0mg/mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.1.3.2 果蔬樣品 稱(chēng)水果（橙子，草莓等）樣品各 100 g 加 100 mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入研缽內(nèi)研成勻漿。用百里酚藍(lán)指示劑調(diào)試勻漿酸堿度，若呈紅色，立即用偏磷酸-乙酸溶液稀釋?zhuān)蝗舫庶S色或藍(lán)色則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋。用干凈紗布過(guò)濾一次，再用高速冷凍離心機(jī)離心取上清液，備用。

2 結(jié)果

通過(guò)直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、熒光分光光度法（鄰苯二胺體系、苯甲酸體系），從精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、回收率考察VC含量的測(cè)定方法，完善藥典和食品中維生素C含量測(cè)定的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)合理攝入維生素C，正確推廣健康飲食。

2.1 直接碘量法 維生素C烯二醇基具有還原性，能被I2定量地氧化成二酮基，因而可用I2標(biāo)準(zhǔn)溶液直接測(cè)定。C6H8O6＋I(xiàn)2= C6H6O6＋2HI

2.1.1 方法 精確量取維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL，加入10mL HAc（2mol/L）和1mL淀粉指示劑（10g/L），立即用0.05mol/Ll I2標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至穩(wěn)定的淺藍(lán)色，即為終點(diǎn)。計(jì)算維生素C濃度。

2.1.2 結(jié)果性染料，可將還原態(tài)的維生素C氧化成脫氫維生素C，而染料本身從深藍(lán)色被還原成無(wú)色的衍生物。2，6-二氯酚靛酚鈉在酸性條件下呈紅色。在滴定終點(diǎn)之前，滴下的2，6-二氯酚靛酚鈉立即被還原成無(wú)色。當(dāng)溶液從無(wú)色轉(zhuǎn)變成微紅色時(shí)，即為滴定終點(diǎn)。

表1 直接碘量法

2.2.1 方法 取2，6-二氯酚靛酚230mg，加入適量4%HCl使其溶解，加210mgNaHCO3，500 mL蒸餾配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用前過(guò)濾，取續(xù)濾液。精確量取標(biāo)準(zhǔn)維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液5.00 mL，加入10 mL 2mol/L HAc 至錐形瓶中，用2，6-二氯酚靛酚標(biāo)定，直至出現(xiàn)微紅色30秒不退色為終點(diǎn)。計(jì)算VC的含量

2.2.2 結(jié)果

表2 2，6-二氯酚靛酚法

2. 3 紫外分光光度法 維生素 C 在紫外區(qū) 246.0nm 處有最大吸收，并且線(xiàn)性良好因此可以采用紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)量。

2.3.1 方法

2.3.1.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 取維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，得維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，從中取0.00mL、1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至50.00mL，以蒸餾水做參比，在246.0nm處測(cè)定吸光度，繪制吸光度A與濃度C的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3.1.2 VC含量的測(cè)定 精確量取維生素C標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液1.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，以蒸餾水做參比，波長(zhǎng)246.0nm處測(cè)定吸光度。

2.3.2 結(jié)果

圖1 紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表3 紫外分光光度法

2.4 熒光分光光度法-鄰苯二胺體系 維生素C樣品在酸性條件下經(jīng)活性炭氧化成脫氫抗壞血酸，與鄰苯二胺反應(yīng)生成有熒光的喹唔啉，測(cè)定喹唔啉熒光值，計(jì)算維生素 C 的含量。

2.4.1 方法

2.4.1.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密量取10.00mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)液至100.00mL容量瓶用蒸餾水稀釋至刻度，加入2g活性炭，過(guò)濾，收集續(xù)濾液，作為標(biāo)準(zhǔn)氧化儲(chǔ)備液，備用，精密量取1.00mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL標(biāo)準(zhǔn)氧化儲(chǔ)備液，于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸鈉（3%），用蒸餾水定容至50.00mL，搖勻，得標(biāo)準(zhǔn)氧化液，取上述標(biāo)準(zhǔn)氧化液5.00mL，加入鄰苯二胺溶液（0.02%）5mL，混合反應(yīng)35分鐘，測(cè)定熒光強(qiáng)度。以不含鄰苯二胺作為空白對(duì)照液，以濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.4.1.2 含量的測(cè)定 精確量取10.00mL維生素C標(biāo)準(zhǔn)樣品液置100.00mL容量瓶，用水稀釋至刻度，搖勻，加入2g活性炭，過(guò)濾，棄去初濾液，收集濾液，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品氧化儲(chǔ)備液，備用。取1.00mL標(biāo)準(zhǔn)樣品氧化儲(chǔ)備液置于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸鈉，用水稀釋至刻度，搖勻，從中取1.00mL，加入鄰苯二胺溶液5mL，混合反應(yīng)35分鐘，測(cè)定熒光強(qiáng)度，以不含鄰苯二胺作為空白對(duì)照液。

2.4.2 結(jié)果

表4 熒光分光光度法-鄰苯二胺體系

2.5 熒光分光光度法-苯甲酸體系

2.5.1 原理 維生素 C經(jīng)Cu2+氧化為脫氫抗壞血酸，與苯甲酸及十六烷基三甲基溴化銨產(chǎn)生熒光協(xié)同增敏作用。

2.5.2 方法

2.5.2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 精密量取維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml，加入適量10%鹽酸溶液，加蒸餾水定容至

100.00 mL，得到5μg/mL VC稀釋液。取5個(gè)50mL容量瓶，加入1.20mL硫酸銅（0.2%）、4.00mL十六烷基溴化銨溶液（0.06%）、4.00mL苯甲酸（0.01%），再向5個(gè)容量瓶中依次加入1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00 mL 維生素C稀釋液后加入10.00mL磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖溶液，定容，搖勻。在35℃恒溫水浴加熱

30min，在發(fā)射波長(zhǎng)417nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度F，無(wú)VC試劑為空白F0，記為△F=F-F0。

2.5.2.2 含量的測(cè)定 精確量取維生素C標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液10mL，加入適量10%HCl，于100mL容量瓶中，定容，搖勻，得維生素C標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液。在50mL的容量瓶中加入1.20mL硫酸銅、4mL十六烷基溴化銨溶液、4mL苯甲酸，一定體積維生素C標(biāo)準(zhǔn)樣品儲(chǔ)備液，10mL磷酸氫二鈉-磷酸氫二鉀緩沖溶液，定容。在35℃恒溫水浴加熱30min，冷卻至室溫，在發(fā)射波長(zhǎng)417nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度F，無(wú)VC試劑為空白F0，記為△F=F-F0。

2.5.3 結(jié)果

表5 熒光分光光度法-苯甲酸體系

圖2 熒光分光光度法-苯甲酸體系

圖3 熒光分光光度法-苯甲酸試驗(yàn)

2.6 橙子中VC含量測(cè)定，優(yōu)選測(cè)定方法

表6 五種方法測(cè)定橙子比較結(jié)果（n=3）

經(jīng)過(guò)五種方法的比較，我們發(fā)現(xiàn)熒光法（苯甲酸）體系測(cè)定VC含量準(zhǔn)確度高，由此構(gòu)建熒光法（苯甲酸）體系進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.7 熒光法（苯甲酸）體系方法學(xué)驗(yàn)證。

2.7.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將體系放置不同的時(shí)間進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)放置 15min時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。

圖4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7.2 共存離子干擾試驗(yàn) 測(cè)定濃度為 2μg / m L的維生素 C時(shí)，當(dāng)允許誤差在5%以?xún)?nèi)時(shí)，共存離子的允許量如表7所示。

表7 共存離子允許量

2.7.3 工作曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍、檢出限 配制濃度為0.00，0.01，0.02，0.08，0.10，0.50，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00，12.00，14.00 u g/mL的系列維生素C標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以熒光強(qiáng)度F對(duì)維生素C的濃度。（μg/mL）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)圖5。維生素C濃度在0.02 ～8.0 μg /mL范圍內(nèi)，與熒光強(qiáng)度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為F = 124.18c+ 14.63相關(guān)系數(shù)為0 9998；檢出限為0.0065μg/mI。

圖5 工作曲線(xiàn)

2.7.4 精密度試驗(yàn) 對(duì)3.0 μg /mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0. 12%。

表8 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7.5 測(cè)定果蔬中VC 用熒光分析法（苯甲酸體系）以下五種果蔬中的維生素C進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 果蔬中VC測(cè)量結(jié)果

3 討論

通過(guò)用多種方法對(duì)比和分析同一批次的維生素C含量，發(fā)現(xiàn)在苯甲酸體系中，熒光分光光度法測(cè)定維生素C具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，檢出限低，專(zhuān)屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選為維Vitamin C 測(cè)定方法，該法可應(yīng)用于水果、蔬菜和藥物中維生素C的檢測(cè)，適于推廣。

［1］ 汪東風(fēng). 食品化學(xué) ［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009 .

［2］ Fenech M. Chromosomal damage rate, aging and dims［J］. Acad Sci, 1998: 854: 23-36.

［3］ Jacobson EL, Shieh WM, Huang AC. Maping the role of NAD metabolism in prevention and treatment of carcinogenesis［J］. Mol Cell Biochem, 1999, 193: 59-74.

［4］ 張健, 曹恩華, 秦靜芬, 等. 抗氧化劑對(duì)DNA損傷的保護(hù)作用機(jī)制的研究［J］. 生物物理學(xué)報(bào), 1997, 13(1): 123-126.

［5］ 田曉華, 顧景范, 孫存普. 氧化應(yīng)激與抗氧化維生素的作用［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè), 1996, 23(4): 229-233.

［6］ 國(guó)家藥典委員會(huì)編. 中華人民共和國(guó)藥典［M］. 化學(xué)工業(yè)出版社, 2010, 901.

［7］ 孫振艷, 趙中一, 郭小慧, 等. 熒光分析法測(cè)定維生素C［J］. 化學(xué)分析計(jì)量, 2006, 4: 18-20.

［8］ 李潤(rùn)豐, 趙希艷, 高亞弟.2, 6-二氯靛酚反滴定法測(cè)定紅色果蔬中還原型VC［J］. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2012, 05: 507-509.

［9］ 王佳露, 劉軍. 極譜法檢測(cè)芒果中的維生素C［J］. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2008, 22: 2748.

［10］ L. Casella, 朱仕兄. 利用過(guò)氧化物酶分析果蔬維生素C的快速酶法［J］. 四川果樹(shù), 1993, 02: 43-45.

The preferentialvitamin Canalysis methods apply to fruits and vagetables

Chen Rong, Tang Bi-xi, Li Min, Zhou Hong-yan, Zhang Pei, Zhu Yuan-zhi, He Chun-lian
(Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

Objective To find a accurate and easier acceptable analysis methods, perfecting the pharmacopoeia and the national standard for the determination of vitamin C content in food, and to guide the reasonable intake of vitamin C, right to promote a healthy diet. Methods Comparing with five kinds of method systemly for determination of vitamin C content［2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)］, and analysis the advantages and disadvantages of each method. Results The results shows that 2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)measured the content of vitamin C in the vitamin C absolute error were 0.095mg/mL, 0.094mg/mL, 0.357mg/mL, 0.120mg/mL, 0.009μg/mL Conclusion The method of the most suitable for determination of vitamin C is fluorescence spectrophotometry(benzoic acid system), The vitamin Canalysis methods easy to be applied to fruits and vagetables.

vitamin C; fluorescence spectrophotometry; uv spectrophotometry; 2, 6-Dichlorophenol indophenol method

R652.1

A

1673-016X（2017）02-0186-04

2016-12-10

教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（NO.12A085）；湖南師范大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)通訊作者： 何純蓮，E-mail:chunlianhe68@163.com