沙 亮， 何劍波， 李科志， 陳 闖， 黃 山， 趙蔭農(nóng)， 連 芳， 鄔國斌

(1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學研究生院， 南寧 530021；3 廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 南寧 530021)

特異性下調(diào)LKB1的表達對肝癌細胞侵襲遷移能力的影響

沙 亮1,2， 何劍波1， 李科志1， 陳 闖1， 黃 山1， 趙蔭農(nóng)1， 連 芳3， 鄔國斌1

(1 廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科， 南寧 530021； 2 廣西醫(yī)科大學研究生院， 南寧 530021；3 廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院， 南寧 530021)

目的 研究特異性下調(diào)LKB1的表達對肝癌細胞系SK-hep-1遷移侵襲能力的影響。方法 Real-time PCR和Western Blot檢測人肝癌細胞株和人正常肝細胞HL7702中LKB1表達情況。設計并合成LKB1特異性雙鏈小干擾RNA(LKB1-siRNA)，轉(zhuǎn)染到高表達LKB1的人肝癌細胞株SK-hep-1中靶向沉默LKB1基因表達，并設置陰性對照組(NC組)。Real-time PCR和Western Blot檢測LKB1基因的mRNA水平與蛋白表達水平的變化。利用CCK-8法檢測肝癌細胞增殖能力。通過體外Transwell小室基質(zhì)侵襲和遷移實驗，觀察LKB1表達沉默后對人肝癌細胞株SK-hep-1侵襲遷移能力的影響。計量資料兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結(jié)果 與正常人肝細胞HL7702相比，LKB1基因和蛋白在人肝癌細胞SK-hep-1中高表達(P值均<0.05)。與NC組相比，siLKB1-1處理組SK-hep-1細胞中的LKB1基因和蛋白表達均明顯降低(P值均<0.05)。與NC組相比，siLKB1-1轉(zhuǎn)染的SK-hep-1細胞增殖速度明顯加快、侵襲和遷移能力明顯增強(1.393±0.022 vs 1.128±0.032、147±19 vs 83±21、113±13 vs 75±17；t值分別為15.313、14.879、8.791；P值均<0.001)。結(jié)論 LKB1有可能參與抑制肝癌增殖、侵襲遷移的過程并影響肝癌的預后。

癌， 肝細胞； LKB1； 細胞增殖； 腫瘤侵潤； 細胞運動

LKB1(liver kinase B1)基因又名STK11(serine/thronine protein kinase 11)基因。是由433個氨基酸構(gòu)成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，分子量60 kD，包括激酶區(qū)域、N端調(diào)節(jié)域和C端調(diào)節(jié)域。LKB1在人體組織中廣泛表達，且參與調(diào)控多種生物學過程，如細胞能量代謝、細胞周期、細胞增殖及細胞極性。LKB1胚系突變是導致黑色素斑-胃腸多發(fā)性息肉綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)的主要原因，PJS后期發(fā)生腫瘤的風險比健康人群要顯著升高[1]。目前研究表明，LKB1作為一個抑癌基因在多種惡性腫瘤中呈低水平表達，如非小細胞肺癌[2]、乳腺癌[3]、胃癌[4]、胰腺癌[5]、肝癌[6]等。LKB1表達缺失時會破壞上皮細胞的極性而促進腫瘤進展、侵襲、轉(zhuǎn)移[7]。在癌基因KrasG12D突變肺癌小鼠模型中，伴隨LKB1的缺失會顯著縮短腫瘤潛伏期，增加腫瘤負擔，促進肺癌的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移[8]。在乳腺癌中過表達LKB1能夠顯著抑制乳腺癌細胞的侵襲遷移及血管生成的過程[9]。同時發(fā)現(xiàn)LKB1高表達與乳腺癌的總生存期呈正相關[10]。此外，在肝癌患者中LKB1的低表達可能是一個不良的預后因子。本實驗利用RNA干擾技術，以高表達LKB1蛋白的肝癌細胞株SK-hep-1為研究對象，針對LKB1基因沉默表達后探討SK-hep-1細胞的生物學行為改變，為進一步研究肝癌的發(fā)病機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞系 人正常肝細胞系HL7702、人肝癌細胞系SK-hep-1、HepG2、SSMC7704細胞來源于上海生命科學院細胞庫，由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑 小鼠抗人LKB1單克隆抗體、兔抗人β-actin購自Cell Signaling Technology公司、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)抗體購自碧云天公司；DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰酶購自Gibco公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自TOYOBO公司。BCA試劑盒購自凱基公司。

1.1.3 小干擾RNA(siRNA)基因序列的設計 由上海吉瑪基因化學技術有限公司設計并合成3條特異性抑制LKB1基因表達的siRNA和1條無關對照序列(NC)。siRNA針對的LKB1目的序列見表1。將含有siRNA粉劑的EP管離心后利用附贈的DEPC水溶解為儲存液，放置-20 ℃冰箱備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人正常肝細胞系HL7702、人肝癌細胞SK-hep-1、HepG2、SSMC7704在含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基中維持生長，細胞置于37 ℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達到80%～90%時，用含有EDTA的胰蛋白酶進行消化，并以1∶3或1∶4的比例進行傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h取對數(shù)生長期的SK-hep-1細胞消化計數(shù)，以3×105細胞/孔接種于6孔板中，當細胞融合度達到70%～90%時，按照Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分為陰性對照組(NC)、實驗組1(siLKB1-1)、實驗組2(siLKB1-2)和實驗組3(siLKB1-3)。為了檢驗轉(zhuǎn)染效率，SK-hep-1細胞轉(zhuǎn)染了FAM標記的siRNA,轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。1.2.3 Real-time PCR檢測LKB1 mRNA的表達水平 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞采用Trisol試劑提取總RNA，核酸濃度檢測儀測定其濃度和純度，按照TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。引物序列見表1。按照TOYOBO Real-time PCR試劑盒操作步驟進行LKB1基因擴增并以β-actin作為內(nèi)參進行實驗，反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火并延伸45 s，共進行40個反應循環(huán)；反應結(jié)束建立溶解曲線。同一實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法計算。

表1 siRNA及引物序列

1.2.4 Western Blot 檢測細胞中LKB1蛋白的表達 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞棄去培養(yǎng)液，用預冷PBS洗滌細胞3次，根據(jù)細胞數(shù)量加入適量的裂解液(按1∶100的比例加入蛋白酶抑制劑PMSF)，晃動混勻后置于冰上充分裂解細胞30 min，4 ℃、12000 r/min離心15 min,收集上清，獲得細胞總蛋白。按照凱基BCA蛋白含量檢測試劑盒說明書檢測各組總蛋白含量。調(diào)整蛋白質(zhì)樣品濃度，使每孔蛋白質(zhì)上樣量為60 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，封閉過后按照anti-LKB1(1∶100)、anti-β-actin(1∶1000)、4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜4次，每次10 min，再分別與相應的辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，增強化學發(fā)光檢測。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞的增殖曲線 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞消化收集離心重懸，利用血細胞計數(shù)器計數(shù)各組細胞。以5000細胞/孔接種于96孔板中，每組設6個復孔。在細胞貼壁后24、48、72 h檢測各組細胞的生長情況，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，放置于細胞培養(yǎng)箱，2 h后上機檢測每孔光密度(OD)值，繪制生長曲線。

1.2.6 細胞侵襲能力檢測 將Matri-gel膠置于4 ℃過夜，用無血清預冷的DMEM培養(yǎng)基按1∶6稀釋Matri-gel膠混勻，每孔60 μl均勻鋪在24孔Transwell上室的聚碳酸脂膜上，37 ℃過夜。收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組細胞，消化用無血清培養(yǎng)基重懸細胞計數(shù)，按每孔1×105/200 μl接種于上室。將小室置于24孔板中，下室加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上室未穿膜的細胞，PBS洗滌2次，700 μl甲醇固定30 min，吉姆薩染色液染色30 min，PBS洗滌干凈，室溫晾干。顯微鏡下取5個隨機視野計數(shù)，計算平均值，每組重復2～3次。

1.2.7 細胞遷移能力檢測 Transwell小室不鋪Matri-gel膠，按細胞數(shù)目為每孔1×104/200 μl接種于上室，其余實驗步驟同1.2.6節(jié)。

2 結(jié)果

2.1 LKB1在肝癌細胞系與正常肝細胞中的表達差異 采用Real-time PCR和Western Blot法檢測細胞系中LKB1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化。結(jié)果顯示相對于正常肝細胞HL7702，LKB1 mRNA在SK-hep-1細胞中的表達要顯著高于肝癌細胞HepG2、SSMC7704(P<0.05)；LKB1 蛋白水平在SK-hep-1細胞中的表達也明顯高于HepG2、SSMC7704、HL7702(P<0.05)(圖1)。

圖1 LKB1 mRNA和蛋白在肝癌細胞系與正常肝細胞中的表達情況 a: LKB1 mRNA表達情況。與肝癌細胞HepG2、SSMC7704比較，*P<0.05; b:Western Blot 檢測LKB1蛋白表達情況

2.2 siRNA轉(zhuǎn)染SK-hep-1細胞后LKB1 mRNA和蛋白水平表達情況 Real-time PCR法檢測siRNA干擾LKB1基因后在mRNA水平的表達變化，結(jié)果顯示，siLKB1-1處理組LKB1的mRNA表達相對NC組明顯降低(P<0.05)。Western Blot 法檢測siRNA干擾LKB1基因后蛋白水平的表達變化，結(jié)果顯示，LKB1-1處理組LKB1的蛋白表達相對NC組明顯降低(P<0.05)，說明細胞SK-hep-1中的LKB1基因被有效沉默，所以選擇siLKB1-1來進行后續(xù)實驗(圖2)。

圖2 SK-hep-1細胞轉(zhuǎn)染LKB1-siRNA后LKB1 mRNA和蛋白表達情況 a:LKB1 mRNA的表達情況。與NC組比較，*P<0.05;b: LKB1蛋白表達情況

2.3 CCK-8檢測細胞的生長 CCK-8檢測細胞增殖的結(jié)果顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染siLKB1-1后的SK-hep-1細胞增殖在72 h加快(1.393±0.022 vs 1.128±0.032)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=15.313,P<0.001)(圖3)。

圖3 siLKB1-1轉(zhuǎn)染后肝癌細胞的增殖能力變化與NC組比較，*P<0.001

2.4 下調(diào)LKB1后肝癌細胞遷移能力的變化 利用Transwell遷移實驗檢測特異性下調(diào)LKB1表達后SK-hep-1細胞遷移能力的變化，結(jié)果顯示，與NC組相比，實驗組細胞遷移數(shù)目增多(147±19 vs 83±21)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=14.879,P<0.001)(圖4)。

圖4 siLKB1-1轉(zhuǎn)染SK-hep-1細胞后對細胞遷移能力的影響(吉姆薩染色，×100)

2.5 下調(diào)LKB1后肝癌細胞侵襲能力的變化 顯微鏡下計數(shù)各組穿過基底膜的細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，與NC組相比，實驗組穿過基底膜的細胞數(shù)增加(113±13 vs 75±17)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.791，P<0.001)(圖5)。

圖5 siLKB1-1轉(zhuǎn)染SK-hep-1細胞后對細胞侵襲能力的影響(吉姆薩染色，×100)

3 討論

目前根治性手術切除仍是治療原發(fā)性肝癌的主要方法[11]，但術后肝癌易復發(fā)轉(zhuǎn)移的特點使得5年生存率仍不理想。由于肝癌發(fā)生過程隱匿，病情進展迅速，惡性程度高，早期癥狀不明顯，致絕大部分患者就診時已是腫瘤晚期或是出現(xiàn)了肝外轉(zhuǎn)移，失去根治性手術切除的機會。雖然目前認為綜合治療肝癌可以發(fā)揮各自的優(yōu)勢，能夠提高患者的預后[12]，但是肝癌易復發(fā)轉(zhuǎn)移的特點也使得遠期療效欠佳。因此，深入研究腫瘤侵襲遷移的分子機制并探索有效的預防和治療措施具有重要的臨床意義。

肝癌和大多數(shù)腫瘤一樣，是一個多因素、多步驟、多基因共同作用的結(jié)果，涉及腫瘤細胞的增殖、血管生成、侵襲、遷移等一系列生物學過程。LKB1作為一個抑癌基因，其編碼產(chǎn)物為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過自身磷酸化或者磷酸化下游底物發(fā)揮功能。有研究[13]表明，其在多種惡性腫瘤中表達缺失并參與惡性進展。在能量下降的情況下，LKB1作為AMPK的上游，能夠磷酸化AMPK，從而激活AMPK，實現(xiàn)對mTOR活性的負性調(diào)控，并進一步影響腫瘤的進展。在胰腺癌的研究中，LKB1下調(diào)可能通過減少p53/p21依賴的生長抑制作用來促進胰腺導管腺癌的發(fā)生[5]。在乳腺癌細胞中過表達LKB1可能通過上調(diào)p21WAF/CIP1和下調(diào)Cyclin D1、Cyclin E的表達來抑制細胞增殖[10]。通過敲除小鼠LKB1基因，發(fā)現(xiàn)小鼠死于胚胎期，解剖發(fā)現(xiàn)血管發(fā)育異常，進一步發(fā)現(xiàn)敲除LKB1后血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達明顯上升，故推測LKB1可能通過下調(diào)VEGF發(fā)揮對腫瘤的抑制作用[14]。有研究[15]發(fā)現(xiàn)LKB1的失活突變通過mTOR-HIF-1α信號軸調(diào)控賴氨酰氧化酶表達上調(diào)，促進肺癌細胞的侵襲能力。有研究[16]表明，在胃癌中LKB1通過下調(diào)CD44的表達來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在膽管細胞癌中，低表達LKB1通過調(diào)控Wnt/β-catenin來促進疾病的進展[17]。但LKB1在肝癌中的具體調(diào)節(jié)作用機制目前還不是十分明確。另有研究[18]表明，肝癌中低表達LKB1與該疾病的臨床進展有密切關系，LKB1低表達的肝癌患者預后更差，提示LKB1的低表達可能是導致肝癌發(fā)生發(fā)展的機制之一。

RNA干擾是一種目前常用的基因沉默技術，利用小分子雙鏈RNA高效、特異地阻斷細胞內(nèi)特定基因的表達，促使mRNA降解，進而誘導細胞表現(xiàn)出某種特定基因缺失的表型[19]。本實驗通過針對LKB1基因有效干擾的siRNA，將其轉(zhuǎn)染至高表達LKB1的肝癌細胞株SK-hep-1中沉默LKB1基因的表達，然后檢測該細胞系體外生物學行為的改變，從而研究下調(diào)LKB1 表達后是否可以增強肝癌細胞的侵襲遷移能力。Transwell小室模型是用來研究體外腫瘤細胞侵襲遷移能力的經(jīng)典實驗方法，通過模擬腫瘤細胞降解細胞外基質(zhì)和穿過基底膜的侵襲遷移過程。通過熒光定量PCR及蛋白印跡實驗結(jié)果提示，LKB1 mRNA及蛋白表達水平均明顯受到抑制，說明轉(zhuǎn)染siRNA后成功沉默了LKB1在細胞中的表達，為后續(xù)實驗提供了實驗模型。然后通過CCK-8法檢驗了沉默LKB1后SK-hep-1細胞的增殖能力。通過Transwell小室侵襲、遷移模型檢驗了沉默LKB1后SK-hep-1細胞的侵襲、遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，下調(diào)LKB1基因的表達后SK-hep-1細胞的增殖、侵襲、遷移能力均明顯增強，說明LKB1作為一個抑癌基因，其低表達與肝癌的惡性生物學行為有關。但是，LKB1基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中起到的作用及調(diào)控惡性生物學行為中的作用機制及詳細調(diào)控網(wǎng)絡,還有待進一步實驗去探究闡明。

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引證本文：SHA L, HE JB, LI KZ, et al. Influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of hepatoma cells[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(5)： 875-879. (in Chinese) 沙亮, 何劍波, 李科志, 等. 特異性下調(diào)LKB1的表達對肝癌細胞侵襲遷移能力的影響[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(5): 875-879.

(本文編輯：朱 晶)

Influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of hepatoma cells

SHALiang,HEJianbo,LIKezhi,etal.

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To investigate the influence of specific down-regulation of LKB1 expression on invasion and migration of the hepatoma cell line SK-hep-1. Methods Quantitative real-time PCR (RT-PCR) and Western blot were used to measure the expression of LKB1 in the human hepatoma cell line SK-hep-1 and normal hepatocytes (HL7702). LKB1 specific double-strand small interfering RNA was designed, synthesized, and then transfected into the human hepatoma cell line SK-hep-1 with high expression of LKB1 to silence the expression of LKB1 gene. A negative control (NC) group was established. RT-PCR and Western blot were used to measure the changes in the mRNA and protein expression of LKB1. Cell Counting Kit-8 was used to measure the proliferative capacity of hepatoma cells. In vitro Transwell chamber invasion and migration assays were used to observe the influence of LKB1 gene silencing on invasion and migration of the human hepatoma cell line SK-hep-1. Thet-test was used for comparison of continuous data between two groups; a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between any two groups. Results Compared with normal human hepatocytes (HL7702), SK-hep-1 cells had significantly higher mRNA and protein expression of LKB1 (bothP<0.05). Compared with the NC group, the siLKB1-1 treatment group had significant reductions in the mRNA and protein expression of LKB1 in SK-hep-1 cells (bothP<0.05). Compared with the NC group, the siLKB1-1 treatment group had a significantly higher cell proliferation rate and significant increases in invasion and migration (1.393±0.022 vs 1.1284±0.032,t=15.313,P<0.001; 147±19 vs 83±21,t=14.879,P<0.001; 113±13 vs 75±17,t=8.791,P<0.001). Conclusion LKB1 may be involved in inhibiting the proliferation, invasion, and migration of hepatoma cells and can affect the prognosis of patients with liver cancer.

carcinoma, hepatocellular； liver kinase b1； cell proliferation； neoplasm invasiveness； cell movement

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.016

2017-01-16；

2017-03-09。

國家自然科學基金資助項目(81460426)；國家自然科學基金資助項目 (81360315)；廣西自然科學基金資助項目 (2014GXNSFAA118191)

沙亮(1990-)，男，主要從事肝膽腫瘤方面的研究。

鄔國斌，電子信箱: gb.wu@139.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)05-0875-05