李靜 沈益民 林圣云 陳珍珍

●論 著

BIIB021對(duì)MDS細(xì)胞株Skm-1增殖的多靶點(diǎn)抑制作用研究

李靜 沈益民 林圣云 陳珍珍

目的 探討熱休克蛋白90（HSP-90）抑制劑BIIB021對(duì)骨髓增生異常綜合征（MDS）細(xì)胞株Skm-1增殖的多靶點(diǎn)抑制作用。方法 分別將0、100、200、400nmol/L BIIB021作用于4組Skm-1細(xì)胞（對(duì)照組、100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組），培養(yǎng)24h后采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR復(fù)合物1（mTORC1）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α)蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 各組Skm-1細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組Skm-1細(xì)胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），即100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組Skm-1細(xì)胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，且400 nmol/L組表達(dá)水平最低。 結(jié)論 BIIB021通過(guò)抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表達(dá)抑制Skm-1細(xì)胞增殖。

HSP-90 骨髓增生異常綜合征 mTORC1 HIF-1α

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一組異質(zhì)性、克隆性造血干細(xì)胞疾病，其主要特征是骨髓中原始細(xì)胞增多伴一系或多系發(fā)育異常（病態(tài)造血），并具有向急性白血病轉(zhuǎn)化的高風(fēng)險(xiǎn)。由于MDS的異質(zhì)性，臨床對(duì)部分非典型MDS患者的診斷及預(yù)后評(píng)估存在困難；且MDS化療療效不佳，目前普遍認(rèn)為其是不可治愈的。近年來(lái)，化療藥物地西他濱的應(yīng)用及骨髓移植治療的開(kāi)展雖挽救了小部分MDS患者的生命，但醫(yī)療費(fèi)用昂貴、不良反應(yīng)大、有效率低，大部分患者病情惡化死亡。因此，臨床迫切需要高效的藥物應(yīng)用于MDS的治療。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白90（HSP-90）抑制劑BIIB021能顯著抑制MDS細(xì)胞株Skm-1細(xì)胞增殖，并引起細(xì)胞凋亡[1]。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR復(fù)合物1（mTORC1）、低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是HSP-90介導(dǎo)的信號(hào)通路靶點(diǎn)蛋白?；诖?，本研究將不同濃度BIIB021作用于 Skm-1細(xì)胞，采用 Western blot法檢測(cè) mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平，旨在探討B(tài)IIB021對(duì)Skm-1細(xì)胞增殖的多靶點(diǎn)抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MDS細(xì)胞株Skm-1由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院惠贈(zèng)；BIIB021購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司，用二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Cell-Signaling Technology公司）溶解為濃度1mmol/L，－20℃保存；胎牛血清、RPMI 1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，mTORC1、HIF-1α抗體購(gòu)自美國(guó)Cell-Signaling Technology公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自以色列Biological Industries公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Skm-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度中培養(yǎng)。

1.3 Western blot法檢測(cè)mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Skm-1細(xì)胞，分別懸浮于10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，按1×105個(gè)/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶，使每瓶終體積為10ml。加入不同體積的BIIB021使4組藥物濃度分別為0、100、200、400nmol/L（對(duì)照組、100nmol/L組、200nmol/L組、400nmol/L組），37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。1 000r/min離心5min收集各組細(xì)胞，加入裂解液冰上放置30min，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理后（160W，持續(xù)5s，間隔5s，工作5次），4℃，12 000r/min離心15min，收集細(xì)胞及其上清液于1.5ml離心管中，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取45μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，開(kāi)始電壓為60V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓增至120V。電泳結(jié)束后，400mA恒流濕轉(zhuǎn)100min將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗4℃搖床過(guò)夜，用1×TBST洗去非特異性結(jié)合的蛋白，加入二抗，室溫溫育2h，再用1×TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化學(xué)發(fā)光底物顯色，X線曝光后顯影定影。每個(gè)蛋白檢測(cè)重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件測(cè)量蛋白條帶灰度值，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采取LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組Skm-1細(xì)胞mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組S k m-1細(xì)胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表達(dá)電泳圖

由圖1、表1可見(jiàn)，各組Skm-1細(xì)胞mTOR蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組Skm-1細(xì)胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；組間兩兩比較差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），即100 nmol/L組、200 nmol/L組、400 nmol/L組Skm-1細(xì)胞mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，且400 nmol/L組表達(dá)水平最低。

表1 各組S k m-1細(xì)胞m T O R、m T O R C 1、H I F-1 α蛋白表達(dá)水平比較（灰度值）

3 討論

HSP-90是很有前景的腫瘤治療靶點(diǎn)[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)，HSP-90在MDS患者中高表達(dá)會(huì)影響疾病預(yù)后，并會(huì)使轉(zhuǎn)化為白血病的風(fēng)險(xiǎn)增高[3]。BIIB021是第一代人工合成的HSP-90抑制劑，有研究報(bào)道稱(chēng)HSP-90抑制劑BIIB021對(duì)實(shí)體腫瘤和某些惡性血液系統(tǒng)疾病有較明顯的抑制作用，并已進(jìn)入臨床研究階段[4]。筆者團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)不同濃度（100、200、400nmol/L）BIIB021作用于Skm-1細(xì)胞后能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，24、48h的細(xì)胞半抑制濃度分別為355.69、168.6 nmol/ L，并通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K/Akt）、核因子κB（NF-κB）作用促進(jìn)Skm-1細(xì)胞凋亡。本研究是在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Western blot法檢測(cè)BIIB021作用于Skm-1細(xì)胞后的mTOR、mTORC1、HIF-1α蛋白表達(dá)水平；結(jié)果顯示不同濃度（100、200、400 nmol/L）BIIB021作用于Skm-1細(xì)胞后均能明顯下調(diào)HIF-1α、mTORC1蛋白的表達(dá)水平，而對(duì)mTOR蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響。

HIF-1由HIF-1α和HIFβ兩個(gè)亞單位組成，研究表明以HIF-1α升高為表現(xiàn)的骨髓微環(huán)境異常跟MDS疾病進(jìn)展及轉(zhuǎn)化有關(guān)[5]。mTOR在生物體內(nèi)以?xún)煞N復(fù)合物的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTORC1既能被蛋白激酶B（Akt）激活，也能通過(guò)下游產(chǎn)物S6K1對(duì)Akt進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活和遷移等功能；這條通路的活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，還與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移行為相關(guān)[6]；此外這條通路還可通過(guò)抑制HIF-1α蛋白的合成、減少HIF-1α蛋白的轉(zhuǎn)錄和核轉(zhuǎn)錄以及增加HIF-1 mRNA的降解來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[7-8]。

綜上所述，BIIB021通過(guò)抑制mTORC1和HIF-1α蛋白的表達(dá)抑制Skm-1細(xì)胞增殖，其具體的作用機(jī)制有待于臨床進(jìn)一步深入研究。

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BIIB021 inhibits proliferation of myelodysplastic syndrome Skm-1 cells and its mechanism

LI Jing,SHEN Yimin,LIN Shengyue,

et al.Department of Emergency，Zhejiang Hospital,Hangzhou 310013,China

Objective To investigate the effect of HSP-90 inhibitor BIIB021 on the proliferation of myelodysplastic syndrome(MDS)Skm-1 cells and related mechanisms.Methods Skm-1 cells were treated with 100,200 and 400nmol/l BIIB021 for 24h.The expression of proteins mTOR,mTORC1,HIF-1α in Skm-1 cells was examined by Western blot. Results The expression of protein mTOR in Skm-1 cells was not significantly changed after treatment with different concentrations of BIIB021 (P＞0.05).Compared to control group,the expression of mTORC1 and HIF-1α in Skm-1 cells treated with different concentrations of BIIB021 was significantly decreased(P＜0.05),and the expression was the lowest in the group of 400 nmol/L. Conclusion BIIB021 inhibits proliferation of MDS Skm-1 cells through down-regulating the expression of mTORC1 and HIF-1α.

HSP-90 MDS mTORC1 HIF-1α

2 0 1 6-0 7-0 3）

（本文編輯：李媚）

10.12056/j.issn.1006- 2785.2017.39.8.2016- 1016

3 1 0 0 1 3杭州，浙江醫(yī)院急診科

李靜，E-m a i l：l i j i n g 1 1 8 8 3 0@1 2 6.c o m