馬曉玉，劉曉龍，魏茂凱，謝躍洋，張志峰

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東青島266003）

單環(huán)刺螠Bcl-xL基因的鑒定及對硫化物的應激反應

馬曉玉，劉曉龍，魏茂凱，謝躍洋，張志峰

（中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室，山東青島266003）

Bcl-xL是Bcl-2家族中一類重要的抗凋亡因子，其功能主要是抑制細胞凋亡、促進腫瘤發(fā)生。為了探知Bcl-xL在生物硫化物應激中的作用，本實驗以耐硫生物單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）為研究對象，RACE擴增獲得一個長度為1 426 bp的單環(huán)刺螠Bcl-xL全長cDNA序列，推導的氨基酸序列包含Bcl-xL4個保守的BH結構域和1個跨膜區(qū)域。使用該cDNA的完整開放閱讀框序列，構建了原核表達載體pET28a-Bcl-xL，體外誘導表達該重組蛋白；鎳柱純化得到純度為90%的純化蛋白，并制備多克隆抗體。Western blotting結果顯示：單環(huán)刺螠暴露于50 μmol/L硫化物中2 h-24 h內(nèi)其呼吸腸中Bcl-xL含量顯著增加（P<0.05），然而在150 μmol/L硫化物中48 h-72 h內(nèi)其呼吸腸Bcl-xL含量顯著降低（P<0.05），暗示Bcl-xL抑制細胞凋亡途徑在單環(huán)刺螠應對低濃度硫化物暴露時發(fā)揮作用，而在高濃度硫化物暴露下Bcl-xL不能發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用。

單環(huán)刺螠；Bcl-xL；細胞凋亡；硫化物

Bcl-2家族成員可以分為3類：第Ⅰ類含有4個Bcl-2同源結構域（BH1、BH2、BH3、BH4），具有抗凋亡的作用；第Ⅱ類含有3個Bcl-2同源結構域（BH1、BH2和BH3），具有促凋亡的作用；第Ⅲ類只含有BH3結構域，具有促凋亡的作用（Cory et al，2003;郭文娟等，2008;Fulda et al，2010）。Bcl-xL屬于第Ⅰ類Bcl-2蛋白，它可通過3個途徑抑制細胞的凋亡。①Bcl-xL與線粒體凋亡通路（內(nèi)源性凋亡途徑）中的Apaf-1分子結合，阻止Apaf-1的寡聚化，進而抑制Caspase9的活化和細胞的凋亡（Hu et al，1998）；②Bcl-xL通過阻斷Bax（第II類Bcl-2蛋白）對線粒體外膜的破壞發(fā)揮抗凋亡作用（Breckenridge et al，2004）；③Bcl-xL通過干擾死亡誘導信號復合體DISC的組裝，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Casepase-8的活性從而抑制凋亡（Wang et al，2004）。

在應對各種環(huán)境因子時，Bcl-xL的反應不同。四環(huán)素可以上調(diào)人HT1080纖維肉瘤細胞中的BclxL表達，進而抑制細胞凋亡（Chen et al，2000）。然而，綠茶多元酚EGGC卻導致人肝細胞瘤HLE細胞中Bcl-xL的下調(diào)表達，誘導其發(fā)生細胞凋亡（Nishikawa et al，2006）。在人前列腺癌細胞中，二乙胺一氧化氮親核復合體可以抑制Bcl-xL表達，從而抑制腫瘤的增長（Huerta-Yepez et al，2013）。由此，可以通過檢測Bcl-xL表達水平的改變反應細胞應激下的凋亡狀態(tài)。

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）俗稱“海腸子”，隸屬螠蟲動物門（Echiurioidea）、螠綱（Echiurida）、無管螠目（Xenopneusta）、刺螠科（Urchidae），主要棲息在近岸潮間帶或潮下帶泥沙底質(zhì)中。單環(huán)刺螠的硫化物耐受性以及線粒體硫化物氧化解毒機制已經(jīng)被闡述（張志峰等，2006;蒲曉強等，2009;Wang et al，2010；Ma et al，2012a; Ma et al，2012b;Huang et al，2013;Zhang et al，2013）。最近，Liu等（2015）采用數(shù)字基因差異表達技術揭示硫化物的暴露可以引起單環(huán)刺螠組織細胞中MAPKs、NF-κB和凋亡等信號通路中的多個信號分子表達發(fā)生改變。本實驗我們克隆獲得單環(huán)刺螠抗凋亡基因Bcl-xL的全長cDNA序列；使用體外原核表達的Bcl-xL重組蛋白制備多克隆抗體，Western blotting確定不同濃度硫化物應激下單環(huán)刺螠呼吸腸中Bcl-xL的表達，以期探討該基因在單環(huán)刺螠應對硫化物中的作用，為解釋生物耐受硫化物的分子機制提供新的認識。

1 材料與方法

1.1實驗動物

單環(huán)刺螠購自青島市四方路水產(chǎn)市場，產(chǎn)地為煙臺沿海。選擇體表無傷痕，體態(tài)均一的健康個體（33.4±10.4 g），于充氣的海水（17.6±0.3°C，pH 8.01±0.02，鹽度32 PSU）中暫養(yǎng)3 d，每日換水2次，每次換水1/2。

1.2實驗分組與取樣

實驗分為2個實驗組[50 μmol/L硫化物（適度應激濃度）和150 μmol/L硫化物（損傷應激濃度）]和1個對照組（不添加硫化物），每組設3個玻璃培養(yǎng)缸，每缸盛有30 L過濾海水，每缸投放10只單環(huán)刺螠，使用雙層保鮮膜密封玻璃缸口。實驗組的硫化物以母液（10 mmol/L NaHS，pH 8.0）形式加入，采用亞甲基藍標定法（Cline，1969;張際標等，2014）測定硫化物濃度，根據(jù)預實驗結果，每隔2 h添加一次硫化物以維持硫化物濃度的相對恒定。在硫化物處理0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、6 h、24 h、48 h、72 h時分別于各個玻璃缸中取出1只單環(huán)刺螠（每組3只），解剖蟲體取其呼吸腸，PBS（pH 7.4）漂洗后，于液氮中速凍，存于-80℃冰箱中備用。

1.3總RNA提取和cDNA合成

1.4 RACE擴增

從單環(huán)刺螠轉(zhuǎn)錄組（www.ncbi.nlm.nih.gov/ Traces/sra/sra.cgi，accession number：SRA122323）中得到Bcl-xL部分片段序列，設計5′及3′RACE特異引物（5′RACE引物：5′-ATCGAATGCATCCCAGCCGCCTTGT-3′和5′巢式引物：5′-GGTTCTCCGAAGGGTAATGGCGTGC-3′;3′RACE引物：5′-ATCAGCTCGCCATTACCCTTCGGAG-3′和3′巢式引物：5′-GGTTCTCCGAAGGGTAATGGCGTGC-3°）。使用SMARTTMRACE cDNA試劑盒并按照操作指南分別擴增目的cDNA的5′和3′端序列。循環(huán)參數(shù)為94℃5 min；94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。

1.5目的基因的生物信息學分析

使用DNASTAR對5′RACE和3′RACE片段進行拼接，搜索開放閱讀框（Open reading frame，ORF）并預測氨基酸序列。將測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行Blastx同源性分析。使用Clustal X 2.0和DNAMAN進行序列比對分析，使用MEGA 5.0.1鄰位相連（Neighbor-joining）法構建進化樹，bootstrap為1000個循環(huán)。

1.6原核表達載體的構建

根據(jù)目的基因全長cDNA序列設計一對引物（P1：5'-GAGCTCATGGATGTAACAGACT-3'（下劃線標識處為SacⅠ酶切位點）和P2：5'-CTCGAGTCTCACAGCTACCATC-3'（下劃線標識處為XhoⅠ酶切位點），以擴增目的基因的ORF cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收和純化后，連接到pMD18-T載體，再轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞中，送至華大基因進行測序。

將含有目的基因ORF cDNA序列的pMD18-T載體與pET28a載體分別用SacⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收片段后連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.7目的基因誘導表達及鑒定

陽性菌株在卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩過夜，次日以1∶100接種擴大培養(yǎng)，當OD值在600 nm波長下達到0.5時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導表達4 h，離心收集總蛋白。超聲破碎后離心取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.8重組蛋白的純化

取100 mL誘導表達的菌液，4℃，5 000 g離心10 min，去上清，收集菌體。用8 mL預冷的PBS（pH 8.0）重懸，冰浴中超聲15 min（功率20%，超聲4 s，停頓9 s）。將溶液4℃13 700 g離心10 min。去上清，收集沉淀，溶于8 ml Buffer B，冰水中磁力攪拌器攪拌5 h。溶液4℃2 400 g離心10 min，取上清。按說明書用鎳柱純化BclxL蛋白，SDS-PAGE分析鑒定洗脫液中蛋白成分。將純化后的Bcl-xL送生工生物工程（上海）股份有限公司制備多克隆抗體。Western blotting檢驗抗體特異性。

1.9組織總蛋白提取和含量測定

取上述各組單環(huán)刺螠呼吸腸凍存組織，分別在冰浴中用電動勻漿器（Pro Scientific PRO 200，美國）勻漿。利用蛋白提取試劑盒（康為，北京）并按照說明書提取呼吸腸總蛋白，于13700 g離心，取上清即為總蛋白?？偟鞍缀恳耘Ｑ宓鞍诪闃藴?，采用考馬斯亮藍法測定（Bradford，1976）。

1.10 Westernblotting檢測

取各組呼吸腸總蛋白50 μg進行SDS-PAGE電泳分離，用轉(zhuǎn)膜儀（Biorad，美國）在5 mA/cm2的穩(wěn)流條件下轉(zhuǎn)膜20 min將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜（Roche，美國）上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，然后加入Bcl-xL一抗，4℃孵育過夜，次日用TBST（pH 8.0）洗膜5次，每次5 min，再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（BBI，上海），室溫孵育1.5 h，超敏ECL化學發(fā)光液顯色，于ChemiDoc MP imaging system（Biorad，美國）上拍照。用Image Lab軟件將圖像轉(zhuǎn)換成灰度值，以β-actin作為內(nèi)參調(diào)平各樣本的總蛋白量，取目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為蛋白的含量。

1.11數(shù)據(jù)分析

各組樣品中目的蛋白含量使用平均值±標準誤（n=3）表示。顯著性差異使用SPSS 18.0軟件進行獨立樣本T檢驗和單因素方差分析計算，P<0.05代表具有顯著性差異。

2 結果

2.1單環(huán)刺螠Bcl-xL cDNA序列特征

5′和3′RACE擴增片段組裝后獲得一個全長為1426bp的cDNA序列（GenBank注冊號：KT999395），其中ORF長705 bp，編碼234個氨基酸；5′非翻譯區(qū)（Untanslated Regions，UTR）為150 bp，3′UTR為571 bp。生物信息學預測該蛋白的分子質(zhì)量為26.47 kDa，理論等電點8.676；推導的氨基酸序列包含Bcl-xL家族成員共有的4個BH保守結構域和1個跨膜區(qū)（圖1A）；該氨基酸序列與已報道的Bcl-xL氨基酸序列同源，與太平洋牡蠣（Crassostreagigas）的一致性為41%，與菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）的一致性為39%。所構建的系統(tǒng)進化樹結果表明，單環(huán)刺螠Bcl-xL首先與兩種貝類（菲律賓蛤仔和太平洋牡蠣）的Bcl-xL聚類，然后依次與紫海膽、脊椎動物聚類（圖1B）。

圖1 不同物種Bcl-xL蛋白的氨基酸多序列比對（A）和聚類分析（B）

2.2 Bcl-xL重組蛋白的誘導表達和純化

將含有單環(huán)刺螠Bcl-xL ORF序列的pET28a-Bcl-xL載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，1 mmol/L IPTG誘導4 h獲得包涵體形式的重組蛋白。Ni2+-NTA純化后得到純度約為90%的單環(huán)刺螠Bcl-xL蛋白，其分子質(zhì)量約為29 kDa，與預期蛋白大小一致（圖2）。使用純化的單環(huán)刺螠Bcl-xL制備多克隆抗體，Western blotting檢測，該抗體在單環(huán)刺螠呼吸腸總蛋白中顯示單一的特異性條帶（圖2）。

圖2 單環(huán)刺螠Bcl-xL重組蛋白的誘導表達純化及抗體特異性檢測

2.3硫化物應激下Bcl-xL蛋白表達量的變化

Western blotting結果顯示，單環(huán)刺螠暴露在不同濃度硫化物環(huán)境中，其呼吸腸細胞Bcl-xL的應激反應不同（圖3）。實驗期間，對照組中Bcl-xL的表達量未見顯著性變化。

單環(huán)刺螠在50 μmol/L硫化物中暴露1.5 h內(nèi)，其呼吸腸細胞中Bcl-xL表達量基本穩(wěn)定；當蟲體在50 μmol/L硫化物中暴露2~24 h時，其呼吸腸中Bcl-xL表達量顯著增加（P<0.05），并且以暴露2 h時呼吸腸中Bcl-xL表達量為最高，較1.5 h硫化物組高2.1倍，較相同時間對照組高2倍；隨后Bcl-xL表達量顯著降低，并在暴露48~72 h期間，表達量恢復到對照水平（圖3B）。

單環(huán)刺螠暴露在150 μmol/L硫化物中24 h內(nèi)，其呼吸腸細胞中Bcl-xL的表達量呈小幅波動，但未見顯著性差異；當暴露48 h時，Bcl-xL表達量較相同時間對照組顯著降低（P<0.05），僅為對照組的68%，是24 h硫化物組的75%，隨后繼續(xù)降低，至暴露72 h時達到最低值，僅是對照組相同時間的63%（圖3C）。

圖3 硫化物應激下單環(huán)刺螠呼吸腸Bcl-xL含量的Westernblotting檢測

3 討論

Bcl-xL作為一個重要的抗凋亡分子，其序列已在許多物種中報道，它們均以保守的結構域（BH1、BH2、BH3、BH4）而被鑒定（Chipuk et al，2010）。本實驗獲得一個單環(huán)刺螠全長cDNA序列，推導的氨基酸序列中包含4個保守的BH結構域，并與其他物種的Bcl-xL聚類，初步確定該序列為單環(huán)刺螠Bcl-xL全長cDNA序列。Blastx分析已報道物種的Bcl-xL同源性，發(fā)現(xiàn)進化地位越高的物種其Bcl-xL序列的一致性在同一類的各物種之間越高，哺乳動物中Bcl-xLs的一致性最高，約為98%；鳥類中Bcl-xLs的一致性約為70%；魚類中Bcl-xL的一致性僅為50%左右；軟體動物中一致性更低，為30%左右。由于本實驗所得Bcl-xL是螠蟲動物門中的首個序列，所以無法進行同門動物Bcl-xL的同源性比對。我們將單環(huán)刺螠Bcl-xL與已報道的其他物種Bcl-xL同源性進行比對，發(fā)現(xiàn)一致性普遍較低，如：與太平洋牡蠣一致性為41%，與其它物種一致性基本為30%左右，一定程度上體現(xiàn)了低等動物中Bcl-xLs的一致性較低的特點。

重組蛋白的原核體外表達受很多因素影響，其中表達載體、誘導劑的濃度和誘導表達的時間是影響體外表達蛋白的重要因子（馬玉彬等，2010）。pET28a是常見的表達載體，其含有組氨酸標簽，該標簽對蛋白正常折疊影響小，而且還可以與Ni2+-NTA層析介質(zhì)特異性結合，利于純化表達的重組蛋白，所以被廣泛運用于原核表達。吳任等（2006）報道，誘導劑IPTG濃度在0.1~1 mmol/L的范圍內(nèi)均適于重組蛋白的誘導表達，并且在1 mmol/L IPTG時目的蛋白表達量最高（韓俊英等，2011）。本實驗中，我們使用表達載體pET28a，在1 mmol/L IPTG和37℃條件下，成功獲得了單環(huán)刺螠Bcl-xL重組表達蛋白。該蛋白的表達量隨誘導時間的增加逐漸增加，并在4 h達到最高。

Bcl-xL在應對各種內(nèi)外因子的過程中表現(xiàn)不同。外源IL-5基因的導入，引起鼠嗜酸性粒細胞中Bcl-xL蛋白表達量顯著上調(diào)，并促進細胞存活（Schwartz et al，2015）。H2S可以引起老鼠心臟中Bcl-xL蛋白上調(diào)表達，抑制細胞凋亡（Calvert et al，2009）。當在感染虹彩病毒的金目鱸斑鰭細胞系細胞中過表達Bcl-xL時，細胞的線粒體分解減少，細胞活力增強（Chen et al，2015）。相反，二甲氧基酮可引起肝癌細胞中Bcl-xL下調(diào)表達，促進肝癌細胞凋亡，從而改善腫瘤損傷（Khan et al，2011）。綠茶多元酚EGCG的應激可下調(diào)HLE細胞（Nishikawa et al，2006）和A549細胞（Sonoda et al，2014）中Bcl-xL mRNA和蛋白的表達量，誘導細胞凋亡，且隨著綠茶多元酚處理濃度的增加，對Bcl-xL表達抑制效應逐漸增強。由此可見，Bcl-xL的上調(diào)表達，可促進細胞的存活；而其下調(diào)表達，將導致細胞凋亡。本實驗當單環(huán)刺螠暴露在50 μmol/L硫化物中2 h-24 h期間，其呼吸腸細胞中的Bcl-xL蛋白水平顯著上調(diào)（P<0.05），暗示呼吸腸細胞通過提高Bcl-xL的表達以抵抗硫化物暴露可能引起的細胞凋亡，維持機體的正常生理狀態(tài)；但是，當硫化物暴露時間延長至48 h以后，單環(huán)刺螠呼吸腸中的Bcl-xL應激抗凋亡作用減弱甚至消失。

毛地黃黃酮處理人腫瘤細胞，引起B(yǎng)cl-xL蛋白表達量的下調(diào)同時提高了Bax蛋白的表達量，提出Bax/Bcl-xL比例的提高可促進細胞凋亡（Chang et al，2005）。Cao等（2006）報道，盡管10 μM NaHS處理3 h的鼠胰腺泡細胞中Bcl-xL蛋白的表達量未發(fā)生改變，但其Bax蛋白表達顯著上調(diào)，也導致了細胞的凋亡。本實驗，單環(huán)刺螠暴露在150 μmol/L硫化物中24 h內(nèi)未見呼吸腸中Bcl-xL表達量發(fā)生明顯的變化，但在暴露48 h和72 h時呼吸腸中Bcl-xL的表達量顯著下降（P<0.05），暗示單環(huán)刺螠在高濃度（150 μmol/L）硫化物中其Bcl-xL抗凋亡作用受到抑制。張志峰等（2006）報道，單環(huán)刺螠對低濃度硫化物具有較強的耐受能力，而對高濃度硫化物的長期暴露耐受力明顯減弱。由此我們推測，高濃度硫化物的長期暴露，可能導致機體細胞的嚴重損傷而不能自我修復。

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（本文編輯：袁澤軼）

Identification of Bcl-xL gene and its response to sulfide stress in Urechis Unicinctus

MA Xiao-yu,LIU Xiao-long,WEI Mao-kai,XIE Yue-yang,ZHANG Zhi-feng
（Ministry of EducationKey Laboratory of Marine GeneticsandBreeding,Ocean University of China,Qingdao266003,China）

Bcl-xL,a member of Bcl-2 family is an important anti-apoptosis factor participating in the inhibition of cell apoptosis and promotion of tumour forming.In the present study,we employed Urechis unicinctus,a sulfide-tolerant Echiuran worm to investigate the role of Bcl-xL in the response to sulfide exposure.A full-length cDNA of 1,426 bp from U. unicinctus Bcl-xL was cloned by RACE amplification,and the deduced amino acid sequence included 4 conserved BH domains and a transmembrane domain found in all Bcl-xL.A prokaryotic expression vector,pET28a-Bcl-xL was constructed using the open reading frame sequence of U.unicinctus Bcl-xL,and the recombination protein of Bcl-xL was inductively expressed in vitro.The protein of 90%purity was obtained by nickel column purification and the polyclonal antibody was made.Western blotting showed that content of Bcl-xL increased significantly（P<0.05）in the hindgut tissue of U. unicinctus exposed to 50 μmol/L sulfide from 2 h to 24 h,while decreased significantly（P<0.05）in that of 150 μmol/L sulfide from 48 h to 72 h,implying that the Bcl-xL inhibiting apoptosis pathway played a role in U.unicinctus resisting the exposure of lower concentration sulfide,while no apoptosis inhibition of Bcl-xL occurred in the higher concentration sulfide.

Urechis unicinctus;Bcl-xL;cell apotosis;sulfide

Q78

A

1001-6932（2017）02-0182-07

10.11840/j.issn.1001-6392.2017.02.009

2015-12-10；

2016-03-05

國家自然科學基金（31372506）。

馬曉玉（1990-），碩士研究生，主要從事海洋動物應激反應研究。電子郵箱：XiaoyuMa@126.com。

張志峰，教授。電子郵箱：zzfp107@ouc.edu.cn。