徐 鋒， 劉曉琳， 王 超， 戴朝六

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 肝膽脾外科， 沈陽 110004)

前列腺素E1預(yù)處理對膽汁淤積大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

徐 鋒， 劉曉琳， 王 超， 戴朝六

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 肝膽脾外科， 沈陽 110004)

目的 探討前列腺素E1(PGE1)對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 36只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為前列腺素E1組(PGE組)和生理鹽水組(NS組)。PGE組肝缺血前15 min至再灌注60 min經(jīng)門靜脈持續(xù)泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)，NS組給予等量生理鹽水。結(jié)扎膽總管，建立膽汁淤積模型。7 d后Pringle法阻斷入肝血流15 min，于再灌注1、6和24 h，檢測血清生化酶和膽紅素，以及肝組織髓過氧化物酶(MPO)、TNFα、Bcl-2、Bax、熱休克蛋白(HSP)70和病理組織學(xué)改變。結(jié)果 再灌注1、6和24 h，2組TBil和DBil水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組ALT、AST、MPO和TNFα水平均顯著低于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組Bcl-2水平顯著高于NS組，Bax水平顯著低于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。再灌注1 h和6 h，PGE組HSP70 mRNA表達(dá)水平明顯高于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。再灌注24 h，2組HSP70 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PGE組肝組織損傷程度均較NS組輕，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹減輕，肝細(xì)胞壞死減少，肝細(xì)胞索及肝竇結(jié)構(gòu)比較清晰，肝細(xì)胞索排列較規(guī)則，肝竇明顯增寬。結(jié)論 PGE1通過減少中性粒細(xì)胞浸潤和Bax表達(dá)，以及增強(qiáng)HSP70和Bcl-2表達(dá)保護(hù)膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷。

膽汁淤積； 再灌注損傷； 前列地爾； 大鼠, Wistar

惡性膽道梗阻根治性手術(shù)有時需聯(lián)合切除部分肝臟，入肝血流阻斷是切肝時常用的控制術(shù)中出血的方法，隨之難免會引起肝臟缺血再灌注損傷。膽汁淤積會導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙和缺血再灌注前后的能量代謝異常，加重肝損傷[1]。如何減輕膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷一直是困擾肝臟外科醫(yī)生的一個難題。盡管動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)術(shù)前膽道引流能夠減輕缺血后肝臟再灌注損傷[2]，但薈萃分析顯示術(shù)前膽道引流并沒有提高惡性膽道梗阻患者術(shù)后療效和安全性[3]。因此，術(shù)前是否減黃至今仍存在爭議。

藥物預(yù)處理則被證明是一種有效的防護(hù)手段。前列腺素E1(prostaglandin E1, PGE1)具有擴(kuò)張血管、抗血小板聚集等作用，能夠改善肝臟的微循環(huán)，增加其能量代謝和膽汁的分泌，能夠防護(hù)肝臟缺血再灌注損傷[4]。但其在膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷中的防護(hù)機(jī)制尚未闡明，本研究就此機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性Wistar大鼠36只，清潔級，體質(zhì)量(270±20)g，購自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心。PGE1購自北京賽生藥業(yè)有限公司。髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TNFα ELISA試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。Bcl-2和Bax一抗購自SANTA CRUZ生物技術(shù)有限公司。即用型SP免疫試劑盒(SP9000)和DAB顯色試劑盒購自中國北京中山生物技術(shù)有限公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物模型制備及分組 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為PGE1組(PGE組)和生理鹽水組(NS組)，各組再隨機(jī)分為再灌注1、6和24 h亞組。參照文獻(xiàn)[5]將膽總管結(jié)扎后切斷，喂養(yǎng)1周，建立膽汁淤積肝臟模型。造模結(jié)束后離斷肝周韌帶，肝臟缺血前PGE組經(jīng)門靜脈持續(xù)泵入PGE1(0.5 μg·kg-1·min-1)15 min，NS組給予等量生理鹽水。用無創(chuàng)傷動脈夾Pringle法完全阻斷入肝血流，15 min后恢復(fù)肝臟血供。于再灌注期間持續(xù)泵入PGE1或生理鹽水 60 min，并建立膽道內(nèi)引流：將一外徑0.9 mm硬膜外導(dǎo)管插入膽總管，另一端插入十二指腸。分別于再灌注1、6和24 h時取腹主動脈血，靜置，離心，將血清置于-20 ℃冰箱保存，待測生化酶及膽紅素水平。取左外葉肝組織置于10%中性甲醛溶液固定，待做病理檢測。取右葉肝組織，置于液氮，再轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱保存，待測肝組織MPO、TNFα、Bcl-2、Bax和熱休克蛋白(heat shock protein,HSP)70。

1.3 血清生化酶和膽紅素檢測 用全自動生化分析儀檢測血清TBil、DBil、ALT和AST，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成。

1.4 肝組織病理檢測 肝組織塊常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)改變。

1.5 免疫組化檢測Bcl-2和Bax表達(dá) 取10%甲醛溶液固定的肝組織塊，石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，采用SP法測定肝組織中Bcl-2和Bax表達(dá)。兔抗鼠Bcl-2和Bax單克隆抗體均按1∶75稀釋，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹膠封片。細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為Bcl-2、Bax陽性表達(dá)細(xì)胞。用OLYMPUS-B5X型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)掃描，400倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野采集圖像，用圖像分析軟件進(jìn)行分析，測Bcl-2和Bax表達(dá)積分光密度值。

1.6 肝組織MPO活力檢測 稱取質(zhì)量<100 mg的肝組織塊，冰水中勻漿，制成5%肝組織勻漿，4 ℃，16 000 r/min離心10 min，按照試劑盒說明書操作，用紫外分光光度計(jì)460 nm測定其吸光度，檢測MPO活力。1.7 ELISA檢測TNFα表達(dá) 稱取質(zhì)量<100 mg的肝組織，冰水中勻漿，16 000 r/min離心10 min，取上清液。建立TNFα標(biāo)準(zhǔn)曲線，在每一待測品孔加樣品100 μl，混勻后37 ℃水浴120 min。洗滌5次，每孔加一抗50 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加酶標(biāo)抗體100 μl，37 ℃水浴60 min。洗板后每孔加底物100 μl，暗處37 ℃反應(yīng)10 min后加終止液。用全自動酶標(biāo)儀492 nm測定吸光值及TNFα水平。

1.8 RT-PCR檢測肝臟HSP70 mRNA表達(dá) 稱取0.5 g肝組織，加TRIzol提取總RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取RNA的質(zhì)量。用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度。將樣本RNA稀釋成為1 μg/μl，置于-80 ℃冰箱保存。RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照試劑盒說明書操作。采用PCR反應(yīng)體系來檢測目的基因的表達(dá)情況。引物設(shè)計(jì)通過美國國立圖書館Medline基因庫進(jìn)行基因檢索，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司協(xié)助合成。HSP70：上游引物，5′-GCGGGATGTATCGGGTTC-3′；下游引物，5′-TGGACAGGGAGTGCTTGG-3′。β-actin：上游引物，5′-CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC-3′；下游引物，5′-CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG-3′。將2 μl經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA加入25 μl PCR反應(yīng)體系內(nèi)，95 ℃變性，55 ℃退火，72 ℃延伸，HSP70循環(huán)35個周期，β-actin循環(huán)30個周期。所有標(biāo)本都重復(fù)檢測3次。以β-actin作為內(nèi)對照擴(kuò)增，在2%的瓊脂糖溴化乙錠凝膠上電泳，掃描測定PCR產(chǎn)物帶密度，對比HSP70產(chǎn)物帶和β-actin產(chǎn)物帶密度值，相對定量HSP70基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 血清TBil、DBil、ALT和AST水平 再灌注1、6和24 h，PGE組TBil、DBil水平與NS組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。再灌注1、6和24 h，PGE組ALT和AST水平均顯著低于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖1)。

圖1 PGE組和NS組血清膽紅素和生化酶水平

2.2 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 NS組再灌注1 h，肝細(xì)胞腫脹，肝竇變窄，肝細(xì)胞索和肝竇分界不清，中性粒細(xì)胞浸潤增加，肝竇內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集；尤其是再灌注6 h，肝組織結(jié)構(gòu)更加紊亂不清，中央靜脈周圍出現(xiàn)大量壞死的肝細(xì)胞；再灌注24 h，肝細(xì)胞腫脹稍有減輕，肝竇間隙稍有增寬。PGE組再灌注不同時間點(diǎn)肝組織損傷程度均較NS組輕，表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹減輕，肝細(xì)胞索及肝竇結(jié)構(gòu)比較清晰，肝細(xì)胞索排列較規(guī)則，肝竇明顯增寬；尤其是再灌注6 h，肝細(xì)胞壞死明顯較少(圖2)。

圖2 PGE組與NS組肝組織形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×400) a：NS組再灌注1 h；b：PGE組再灌注1 h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

2.3 肝組織Bcl-2和Bax表達(dá) 再灌注1、6和24h，PGE組肝組織Bcl-2表達(dá)水平均顯著高于NS組，平均積分光密度分別為10.259±3.516 vs 3.133±0.588、13.542±1.682 vs 8.172±1.124和6.952±1.419 vs 2.028±0.738；t值分別為3.462、4.598和5.332；P值分別為0.026、0.010和0.006。PGE組Bax 表達(dá)水平均顯著低于NS組，平均積分光密度分別為6.196±1.827 vs 9.835±1.226、7.515±2.179 vs 13.943±3.145和10.375±2.408 vs 16.867±2.943；t值分別為2.865、2.910和2.957；P值分別為0.045、0.043和0.041(圖3，4)。

圖3 PGE組與NS組Bcl-2表達(dá)情況 a：NS組再灌注1h；b：PGE組再灌注1h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

圖4 PGE組與NS組Bax表達(dá)情況 a：NS組再灌注1 h；b：PGE組再灌注1 h；c：NS組再灌注6 h；d：PGE組再灌注6 h；e：NS組再灌注24 h；f：PGE組再灌注24 h

2.4 肝組織MPO水平 再灌注1、6和24 h，PGE組肝組織MPO水平均顯著低于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；且再灌注6 h肝組織MPO水平達(dá)峰值，此后2組MPO水平均有下降趨勢(P值均<0.05)(圖5)。

2.5 肝組織TNFα水平 PGE組再灌注1、6和24 h肝組織TNFα水平均顯著低于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。再灌注6 h，2組肝組織TNFα水平達(dá)峰值，再灌注24 h時2組TNFα水平均有顯著下降(P值均<0.05)(圖6)。

圖5 PGE組與NS組肝組織MPO表達(dá)水平

圖6 PGE組與NS組肝組織TNFα表達(dá)水平

2.6 肝臟HSP70 mRNA表達(dá) 再灌注1 h和6 h，PGE組HSP70 mRNA表達(dá)水平明顯高于NS組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。再灌注24 h，2組HSP70 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PGE組HSP70 mRNA表達(dá)水平隨再灌注時間延長呈逐漸下降趨勢(圖7)。

圖7 PGE組與NS組肝組織HSP70 mRNA表達(dá)水平

3 討論

膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷是肝臟外科時常面臨的一個重要臨床問題。缺血再灌注損傷不但會引起術(shù)后肝功能不全甚至衰竭，而且還能促使腫瘤發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[4,6-7]。如何減輕缺血再灌注對膽汁淤積肝臟的損傷對提高惡性膽道梗阻肝切除患者的生存率具有重要作用。本研究旨在通過PGE1預(yù)處理來防護(hù)膽汁淤積肝臟的缺血再灌注損傷，以期為臨床提供一種可行的方法。

研究結(jié)果顯示：缺血再灌注后血清生化酶ALT和AST呈進(jìn)行性升高，肝細(xì)胞損傷進(jìn)行性加重，再灌注6 h達(dá)峰值，再灌注24 h肝組織損傷逐漸恢復(fù)。PGE1預(yù)處理能顯著降低再灌注后血清ALT和AST水平，減輕肝細(xì)胞損傷，改善肝組織病理改變。眾所周知，ALT和AST是評價肝細(xì)胞損傷程度的常用指標(biāo)。肝臟缺血再灌注時ALT水平與肝細(xì)胞壞死程度和范圍呈正相關(guān)，尤其在再灌注24 h時二者相關(guān)性更加明顯[8]。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了ALT水平與肝細(xì)胞壞死程度的相關(guān)性，說明PGE1預(yù)處理對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。其保護(hù)機(jī)制與以下因素有關(guān)：

(1)減少肝臟中性粒細(xì)胞浸潤。MPO是反映中性粒細(xì)胞浸潤較為敏感的指標(biāo)。TNFα則是浸潤的中性粒細(xì)胞釋放的一個重要細(xì)胞因子[9]。本研究結(jié)果顯示，再灌注后NS組肝組織MPO和TNFα表達(dá)水平均明顯增加，至再灌注6 h達(dá)峰值。這提示缺血再灌注后肝臟中性粒細(xì)胞浸潤增加。肝組織病理也證實(shí)肝竇內(nèi)大量中性粒細(xì)胞聚集。PGE1預(yù)處理后MPO和TNFα表達(dá)水平均顯著下降，說明PGE1能夠減少中性粒細(xì)胞浸潤。這與先前研究[10]結(jié)果吻合。PGE1可通過抑制血小板聚集，改善微循環(huán)[11]；抑制肝竇內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管細(xì)胞黏附分子-1、細(xì)胞間黏附分子-1、P選擇素和E選擇素表達(dá)，從而抑制中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，減少中性粒細(xì)胞與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞黏附和滲出[4,12]。還能抑制TNFα等炎性細(xì)胞因子釋放[11-12]。進(jìn)而減少TNFα介導(dǎo)NF-κB或PGC-1α/Mfn2信號通路引起的肝損傷[13-14]。

(2)提高肝組織對缺血再灌注損傷的應(yīng)激能力。本研究結(jié)果顯示，PGE1預(yù)處理能顯著提高缺血再灌注后肝組織HSP70 mRNA表達(dá)。有研究表明，HSP70 mRNA和蛋白在正常細(xì)胞和非缺血肝組織都檢測不到，只有在應(yīng)激狀態(tài)下(如溫度升高、缺血再灌注、TNFα、內(nèi)毒素和急性炎癥等)才能大量產(chǎn)生。HSP70 mRNA表達(dá)要先于HSP70蛋白，前者在肝缺血早期即有表達(dá)，再灌注后表達(dá)增強(qiáng)；而且隨著缺血時間延長、損傷加重，其表達(dá)也增強(qiáng)；隨著肝損傷逐漸修復(fù)，其表達(dá)也逐漸消退。HSP70蛋白直到再灌注12 h才能檢測到，48～72 h達(dá)高峰[15-16]。HSP70能作用于Kupffer細(xì)胞，抑制其產(chǎn)生活性氧自由基，或是通過抑制氧自由基關(guān)鍵酶NADPH 氧化酶，減少活性氧族的產(chǎn)生，增強(qiáng)肝細(xì)胞耐受力[17-18]。HSP70還能與缺血再灌注時產(chǎn)生的未折疊或變性蛋白結(jié)合，使其維持肽鏈伸展?fàn)顟B(tài)，防止錯誤折疊聚集，恢復(fù)正確的折疊，對無法挽救的變形蛋白加速降解清除，保持肝細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，減少肝細(xì)胞損傷破壞[19]。

(3)減少肝組織Bax表達(dá)，增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，PGE組相對于NS組再灌注后肝組織致凋亡蛋白Bax表達(dá)減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，說明PGE1預(yù)處理能減少肝細(xì)胞凋亡。當(dāng)肝臟缺血再灌注時Bax表達(dá)被激活，導(dǎo)致羧基末端區(qū)域外露，與線粒體外膜結(jié)合，進(jìn)一步促使線粒體釋放caspase3和凋亡誘導(dǎo)因子等[20]。Bax還能與Bcl-2形成異源二聚體，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+，與細(xì)胞色素C相互作用激活caspase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，產(chǎn)生凋亡小體，誘導(dǎo)凋亡形成[21]。Bcl-2作為抗氧化物則能調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，阻止細(xì)胞成分發(fā)生氧化損傷和DNA斷裂，保護(hù)細(xì)胞核免于損傷；此外，還可以影響細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，改變Ca2+分布，抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C[22]。從而抑制肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

總的來說，PGE1通過減少肝內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤和Bax表達(dá)，增強(qiáng)HSP70和Bcl-2表達(dá)，對膽汁淤積肝臟缺血再灌注損傷起到了保護(hù)作用，但其更深入的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯：朱 晶)

Protective effect of prostaglandin E1 pretreatment against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis

XUFeng,LIUXiaolin,WANGChao,etal.

(DepartmentofHepatobiliaryandSplenicSurgery,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,China)

Objective To investigate the protective mechanism of prostaglandin E1 (PGE1) against liver ischemia-reperfusion injury in rats with cholestasis. Methods A total of 36 male Wistar rats were randomly divided into PGE1 group (PGE group) and normal saline group (NS group). The rats in the PGE group were treated with continuous pump of PGE1 (0.5 μg/kg/min) from 15 minutes before liver ischemia to 60 minutes of reperfusion, and those in the NS group were given normal saline of the same volume. Common bile duct ligation was performed to establish a rat model of cholestasis. Seven days later, Pringle maneuver was used to perform hepatic inflow occlusion for 15 minutes, and serum levels of enzymes and bilirubin were measured at 1, 6, and 24 hours of reperfusion, as well as the levels of myeloperoxidase (MPO), tumor necrosis factor α (TNFα), Bcl-2, Bax, and human heat shock protein 70 (HSP70) and histopathological changes. Results At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, there were no significant differences in total bilirubin and direct bilirubin between the two groups (bothP>0.05), and the PGE group had significantly lower levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, MPO, and TNFα than the NS group (allP<0.05). At 1, 6, and 24 hours of reperfusion, compared with the NS group, the PGE group had a significantly higher level of Bcl-2 and a significantly lower level of Bax (both P <0.05). At 1 and 6 hours of reperfusion, the PGE group had significantly higher mRNA expression of HSP70 than the NS group (P<0.05), and at 24 hours of reperfusion, there was no significant difference in mRNA expression of HSP70 between the two groups (P>0.05). Compared with the NS group, the PGE group had a lower degree of liver injury, which manifested as reduced hepatocyte swelling and necrosis, clear structures of the hepatic cords and the hepatic sinusoids, regular arrangement of hepatic cords, and widened hepatic sinusoids. Conclusion PGE1 protects the liver with cholestasis against ischemia-reperfusion injury by reducing neutrophil infiltration and Bax expression and upregulating the expression of HSP70 and Bcl-2. Key words：cholestasis； reperfusion injury； alprostadil； rats, wistar

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.05.022

2016-10-20；

2016-12-05。

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013021068)

徐鋒(1976-)，男，副教授，博士，主要從事肝膽胰疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

戴朝六，電子信箱：daicl@sj-hospital.org。

R575

A

1001-5256(2017)05-0899-06