沈成才 （北京師范大學(xué)克拉瑪依附屬學(xué)校 新疆克拉瑪依 834000）

蘇鐵（Cycas revoluteThunb），蘇鐵科蘇鐵屬，又名鳳尾蕉、金代、鐵樹(shù)等，蘇鐵科植物是世界上最古老的裸子植物，被譽(yù)為“植物的活化石”［1］。蘇鐵對(duì)研究種子植物的起源與演化、種子植物的區(qū)系和古氣候的變遷、基因表達(dá)與調(diào)控、遺傳多樣性和親緣關(guān)系等都有重要意義［2］。蘇鐵RNA的提取對(duì)生物學(xué)特性和分子生物學(xué)的研究至關(guān)重要，較高質(zhì)量的RNA可為Northern雜交、cDNA文庫(kù)建構(gòu)、RT-PCR及RNA編輯位點(diǎn)的研究等提供保證。

現(xiàn)階段植物總RNA的提取技術(shù)已經(jīng)比較成熟，有多種方法可供選擇，例如胍鹽法、SDS法、CTAB法、苯酚法、LiCl沉淀法、異硫氰酸胍法，商品化試劑盒法等［3］。RNA的提取方法很多，但這些方法在RNA提取材料上都具有一定針對(duì)性，適用范圍有限，尤其是裸子植物的RNA提取相對(duì)較難。由于蘇鐵中大量的多糖、多酚等次級(jí)代謝產(chǎn)物在細(xì)胞破碎后會(huì)以不同方式干擾RNA的提取，例如：酚類物質(zhì)氧化后可使RNA活性喪失，多糖可形成難溶膠狀物與RNA沉淀，內(nèi)源RNase及操作體系中的外源RNase的污染［4］，加之RNA的不穩(wěn)定性，使得蘇鐵中RNA的提取難度加大。

通過(guò)閱讀大量文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)針對(duì)蘇鐵中RNA提取方法的研究較少，李璐等人在常規(guī)的CTBA法中，加入硼砂和巰基乙醇提取蘇鐵葉片中的RNA［5］?，F(xiàn)階段，由于小麥總RNA的提取技術(shù)比較成熟［6］。因此，筆者選擇小麥做參照，采用異硫氰酸胍法、試劑盒法和CTAB法提取蘇鐵和小麥RNA，以確定最佳提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 臺(tái)東蘇鐵（Cycas taitungensis），購(gòu)買(mǎi)于西安三森市場(chǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 CTAB,PVP，2-巰基乙醇，LiCl,DEPC，Tris-base，EB， 硼酸，EDTA－2Na， 溴酚藍(lán)，十二烷基肌氨酸鈉，異硫氰酸胍，檸檬酸鈉，水飽和酚酸，亞精胺，植物RNA提取試劑盒，無(wú)水乙醇，液氮，氯仿，異戊醇，異丙醇。

GT溶液（4 mol/L異硫氰酸胍，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.5%十二烷基肌氨酸鈉）；RNA提取液（20 g/L CTAB，20 g/L PVP，50 mmol/L EDTA，4.0 mol/L NaCl）；10×TBE 電泳緩沖液 （108 g Tris；55 g 硼酸；9.3 g EDTA－2Na；1 000 mL；pH 8.0）；1%瓊脂糖凝膠（0.2 g瓊脂糖；1×TBE緩沖液 20 mL；2 μL EB）； 3 mol/L NaAc （pH 5.8），2 mol/L NaAc（pH 4.8），4 mol/L LiCl，0.1%DEPC 水。 天根公司植物總RNA提取試劑盒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 DYY-12型電泳儀；PB-10型pH計(jì)；BS-124S型電子天平；YDS-30型液氮生物容器；DSX-280A型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋；JB-3定時(shí)恒溫磁力攪拌器；DYCP-31DN電泳槽；Centrifuge 5804R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)；Centrifuge 5417C型臺(tái)式高速離心機(jī)；AGX-7601型通風(fēng)櫥；精密微量移液器；GDS-8000型凝膠成像系統(tǒng)；UNICAM UV300型紫外分光光度計(jì)；HH-2B型數(shù)顯恒溫水浴鍋；DW-86L368型超低溫冰箱；GZX-9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱；PE手套，離心管，槍頭。

1.2 方法

1.2.1 異硫氰酸胍法提取植物葉片總RNA

1）稱取0.1 g新鮮植物葉片，加入液氮研磨成粉末，移入預(yù)冷的1.5 mL Eppendorf管中。

2）加入 300 μL GT 溶液，混勻；加入 30 μL 2 mol/L NaAc（pH 4.8），反復(fù)振蕩混勻；加入300 μL 酚酸與 100 μL 氯仿，混勻。

3）4℃，8 000 r/min 離心 15 min， 棄沉淀，取上清移至用DEPC水處理過(guò)的另一干凈離心管中，加入2.5倍體積無(wú)水乙醇，-20℃放置5～6 h。（-20℃可放置過(guò)夜）

4）4℃，8 000 r/min 離心 15 min， 棄上清液。在沉淀中加入100 μL 4 mol/L LiCl，使沉淀溶解。

5）12 500 r/min 離心 15 min，棄上清液；在沉淀中加入100 μL滅菌后的DEPC水，混勻后再加入 50 μL氯仿，50 μL水飽和酚酸混勻。

6）12 500 r/min離心5 min，吸上清液移至另一DEPC水處理過(guò)的1.5 mL Eppendorf管，加入等體積氯仿。

7）12 500 r/min離心5 min。吸上清液移至另一DEPC水處理過(guò)的1.5 mL Eppendorf管，加入1/10體積 3 mol/L NaAc（pH 5.8）和 2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃放置過(guò)夜。

8）12 500 r/min離心 5 min，小心吸去上清液，RNA沉淀在室溫下稍干燥。

9）加入20 μL DEPC處理過(guò)的滅菌水溶解，取5 μL樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（100 V，100 mA，20 min）RNA 質(zhì)量， 并取 2 μL 樣品加入498 μL DEPC處理過(guò)的水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；其余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CTAB法提取植物葉片總RNA

1）取不超過(guò)50 mg植物葉片于研缽中，加液氮研磨成粉末狀;然后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中。

2）加入 600 μL RNA 提取液（預(yù)先在 65℃水浴中保溫 1 h），3 μL 亞精氨和 12 μL β-巰基乙醇，混勻。

3）加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1 即 624 μL∶26 μL），混勻，12 000 r/min，4℃離心 10 min。 用移液槍小心吸取上層清液于另一離心管中，重復(fù)抽提一次（20 μL β-巰基乙醇）。

4）取上清液于另一支1.5 mL離心管中，加入1/4體積的 10 mol/L LiCl混勻過(guò)夜（2 h）。

5）12 000 r/min，4℃離心 20 min。 去上清液，用 100 μL/200 μL DEPC 溶解沉淀。

6）再加上等體積的氯仿-異戊醇抽提，12 000 r/min，4℃ 10 min，然后用移液槍小心吸取上層清液于另一支1.5 mL離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇沉淀RNA，-20℃，2 h。

7）12 000 r/min，4℃離心 20 min。 去上清液，用 750 mL的乙醇洗滌沉淀，加入20 μL DEPC溶解沉淀，取 5 μL樣品經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（100 V，100 mA，20 min） RNA 質(zhì)量，并取2 μL樣品加入498 μL DEPC處理過(guò)的水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；其余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 試劑盒法

1）取不多于0.1 g研磨過(guò)的冷凍蘇鐵葉片，加入0.5 mL提取試劑，振蕩至徹底混勻。

2）室溫放置5 min。平放離心管使表面積增大。

3）12 000 r/min，4℃離心 1 min。 上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中。

4）加入 0.1 mL NaCl，溫和混勻。

5）加入0.3 mL氯仿上下顛倒混勻。

6） 12 000 r/min，4℃離心 10 min。 取上層水相于新的1.5 mL離心管中。（重復(fù)5、6）

7）加所得水相等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min。

8）12 000 r/min，4℃離心 10 min。 去上清液，加1 mL無(wú)水乙醇。

9）12 000 r/min，4℃離心 3 min。倒出液體，室溫晾干。

10）加 50 μL DEPC 水，充分溶解，取 5 μL 樣品經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（100 V，100 mA，20 min）RNA 質(zhì)量， 并取 2 μL 樣品加入 498 μL DEPC處理過(guò)的水，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度；其余樣品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果和分析

通過(guò)比較3種RNA提取方法的電泳結(jié)果，可以看出使用改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵的RNA，28S RNA和18S RNA條帶邊緣清晰，DNA含量少（圖1）；試劑盒法得到的RNA含量很多，但28S RNA和18S RNA條帶模糊，拖帶較為嚴(yán)重。DNA條帶粗而亮，說(shuō)明對(duì)DNA的處理不充分（圖2）；CTAB法提取的RNA的電泳結(jié)果顯示，DNA條帶較亮，DNA雜質(zhì)較為明顯，且28S RNA和18S RNA條帶呈彌散狀，表明RNA分解較為明顯（圖3）。可見(jiàn)，使用改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA較為合適。

圖1 異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA的電泳結(jié)果

圖2 試劑盒法提取蘇鐵總RNA的電泳結(jié)果

圖3 CTAB法提取蘇鐵總RNA的電泳結(jié)果

3 討論與小結(jié)

CTBA法中加入的β-巰基乙醇能有效抑制酚類物質(zhì)的氧化，用氯仿-異戊醇、LiCl沉淀分離出RNA，但效果并不理想，可能并不適合提取臺(tái)東蘇鐵的RNA，或有待進(jìn)一步改進(jìn)；試劑盒法提取臺(tái)東蘇鐵的RNA含量多，但28S RNA和18S RNA的條帶邊緣彌散，樣品中混有較多DNA，降低了產(chǎn)物的純度和效率。購(gòu)買(mǎi)的試劑盒價(jià)格較高，一次提取材料相對(duì)較少，增加了實(shí)驗(yàn)成本。

改良的異硫氰酸胍法提取蘇鐵總RNA的方法中，異硫氰酸胍是一種烈性蛋白變性劑，可抑制RNase的活性，有效解離核蛋白與核酸復(fù)合體，加入的LiCl可以選擇性沉淀RNA，用酚、氯仿、無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑純化RNA。整個(gè)提取RNA的過(guò)程只需勤換一次性PE手套，謹(jǐn)慎在冰上操作，即可提取出質(zhì)量很好的RNA。28S RNA和18S RNA條帶明亮、清晰，且28S RNA的亮度在18S RNA條帶的2倍以上，A260/A280比值在2.0左右。提取的臺(tái)東蘇鐵RNA樣品，在-20℃保存1個(gè)月后仍可用于后續(xù)RT-PCR。改良的異硫氰酸胍法不僅可以提取大量材料，還得到了純度較高的RNA，且樣品中混有的DNA也比較少，有利于一系列基因的下游操作［7］。

可見(jiàn)，采用改良的異硫氰酸胍法比較適合提取臺(tái)東蘇鐵的總RNA，不僅可以得到用于分子生物學(xué)研究的高質(zhì)量RNA，還節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。此方法的研究，為蘇鐵的分子生物學(xué)乃至生物進(jìn)化等方面的研究提供了良好的技術(shù)保證，也為裸子植物的RNA提取方法提供了參考。

［1］Takahiko T， Tatsuya W,Masahiro S.Comparative analysis of RNA editing wites in higher plant chloroplasts.Journal of Molecular Evolution,2001，53(4-5):327.

［2］傅瑞樹(shù).蘇鐵研究的現(xiàn)狀及展望.武夷科學(xué)，2000(16):187.

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［4］楊占軍，谷守琴，張健.幾種植物組織總RNA提取方法的特點(diǎn)及疑難對(duì)策.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37（18）：8341.

［5］LI Lu,FU Qiantang,YU Diqiu.An effective protocol for the isolation of RNA from Cycad Leaves.Acta Botanica Yunnanica.2008,30(5):593.

［6］Tadamasa Sasaki,Yasushi Yukawa,Tetsuya Miyamoto,et al.Identification of RNA EditingSites in chloroplast Transcripts from the Maternal and Paternal Progenitors of Tobacco(Nicotiana tabacum):Comparative analysisshows the involvement of distinct trans-factors for ndhB editing.Molecular.Biology and Evolution,2003,20(7):1028.

［7］Wang Jie,Wang Quan,et al.Comparison and analysis of RNA extracting method from different plant tissues.Journal of Beijing University of Agriculture.2015,30(1):76.

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